تاثیر عصاره برگ گیاه جغجغه( prosopis farcta)بر بیان ژن فسفوفروکتوکیناز-1در موش های صحرایی دیابتی (نوع1)

فصل اول: مقدمه وکلیات

1-1- مقدمه————————————– 2

2-1-کلیات تحقیق——————————— 3

1-2-1-دیابت————————————- 3

2-2-1- انواع دیابت—————————— 3

3-2-1- علائم بروز دیابت————————– 4

4-2-1- درمان دیابت :—————————- 5

3-1- گیاه جغجغه ((Prosopis farcta———————- 8

1-3-1- خواص دارویی جغجغه———————— 8

4-1- فسفوفروکتوکیناز 1(PFK-1):——————– 9

5-1- ضرورت و اهداف تحقیق :——————— 13

فصل دوم: مروری بر منابع

1-2- اثرات ضد دیابتی گیاهان——————– 16

1-1-2- انار———————————— 17

2-1-2-مكانيسم اثر انار در ديابت:————— 17

2-1-2- سیر————————————- 19

2-2- اثر گیاه برفعالیت وبیان ژن—————- 21

فصل سوم: مواد و روشها

1-3- موادو روشها——————————- 25

2-3- تهیه عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه—— 27

3-3- حیوانات آزمایشگاهی———————— 28

1-3-3- نحوه گروهبندی:————————– 28

2-3-3- روش القای دیابت تجربی:—————— 29

3-3-3- اندازه گیری قند و وزن موشها:———— 29

4-3-3- مراحل انجام تشریح:———————- 29

4-3- بررسی بیان ژن—————————– 31

1-4-3- مشخصات توالی ژن PFK-1——————– 31

2-4-3- طراحی پرایمرها————————– 35

3-4-3- آماده سازی پرایمر———————– 35

5-3- استخراج RNA:—————————— 36

1-5-3- استخراج RNA از نمونه های تازه کبد توسط کیت Geneall Hybrid Rtm———————————————– 36

1-5-3- بررسی کمیت و کیفیت RNA  استخراج شده—– 38

6-3- سنتز cDNA——————————— 39

1-6-3- سنتز cDNA توسط کیتThermo SCIENTIFIC——— 39

7-3- واکنش های PCR—————————– 41

1-7-3 – PCR شیب دمایی————————– 41

2-7-3- PCR معمولی—————————— 43

8-3- الکترفورز——————————— 45

1-8-3 – مواد مورد نیازجهت تهیه ژل الکتروفورز— 45

1-1-8-3- آگارز——————————— 45

2-1-8-3- اتیدیوم بروماید———————– 46

3-1-8-3- لودینگ بافر————————— 46

4-1-8-3-طرز تهیه محلول Tris-Hcl——————- 46

4-1-8-3- شناساگرهای اندازهDNA—————– 47

9-3- روش کار با ژل الکترفورز——————- 47

10-3- رسم منحنی استاندارد:——————— 48

10-3- واکنش Real-Time PCR————————– 48

11-3- Threshold و مقدار CT:———————– 50

12-3- تعیین توالی محصولات  (Direct Sequencing) PCR——- 51

10-2-3- آنالیز بیان ژن————————- 52

13-3- تجزیه وتحلیل داده ها——————— 52

فصل چهارم: نتایج و بحث

1-4- جمع آوری نمونه :————————– 54

2-4- بررسی نتایج وزن موشهای مورد مطالعه——– 54

3-4- بررسی نتایج گلوکز ناشتای سرم موشهای مورد مطالعه 56

5-4- نتایج استخراج RNA:———————— 57

6-4- نتایج حاصل ازساخت cDNA بر روی ژل آگاروز— 59

7-4-  نتایج تعیین غلظت و کیفیت RNA توسط اسپکتروفتومتری   61

1-7-4-  نتایج مربوط به PCR شیب دمایی———— 61

8-4- نتایج منحنی استاندارد——————— 62

1-8-4- منحنی استاندارد ژن TBP—————— 63

2-8-4-منحنی استاندارد ژن PFK-1—————— 63

9-4- نتايج واكنش  Real Time PCR———————- 64

1-9-4- تکثیر ژنPFK—————————– 65

2-9-4-تکثیر ژن TBP—————————– 66

10-4- ارزیابی  کارایی تکثیر ژنهای مور مطالعه از طریق آنالیز منحنی ذوب:————————————- 66

1-10-4- منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن  PFK— 67

2-10-4-منحنی تغییرات ذوب بر حسب دمای ژن TBP—- 67

11-4-  آنالیز منحنی ذوب ژن PFK—————— 68

12-4-آنالیز منحنی ذوب ژن TBP——————- 68

13-4- نتایج حاصل از Real timePCR ژن PFK 1 بر روی ژل آگارز 70

14-4- نتایج بررسی بیان ژن PK——————- 70

15-4- بحث:————————————- 71

16-4- پیشنهادات——————————– 73

منابع:—————————————– 75

جدول1-3- تجهیزات و دستگاهها……………….. 26

جدول 2-3 پرایمرهای طراحی شده………………. 35

جدول3-3- لیست اجزای کیت استخراج RNA………… 36

جدول 4-3 موادلازم برای PCR…………………. 42

جدول 5-3 برنامه PCR شیب دمایی برای تکثیر قطعه حاصل از TBP 42

جدول 6-3 برنامه PCR  شیب دمایی برای تکثیر قطعه حاصل از PFK-1  43

جدول7-3 مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Tris-Hcl…. 47

جدول8-3 مواد و میزان مورد نیاز برای یک واکنش در Real-Time PCR    49

جدول9-3 مراحل، دما و زمان مربوطه در یک واکنش Real- time PCR  برای ژن TBP……………………………………….. 50

جدول10-3- شرایط دمایی و زمانی واکنش Real time PCR برای ژن PFK-1   50

شکل 1-1- محل قرارگرفتن فسفوفروکتوکیناز 1 در کروموزوم شماره 21 انسان…………………………………… 10

شکل2-1- فروکتوز 2-6 بی فسفات مهمترین فعال کننده آنزیم فسفوفروکتوکیناز 1………………………… 11

شکل3-1- مراحل گلیکولیز……………………. 12

شکل 1-3- نحوه گاواژ دادن عصاره…………….. 28

شکل 2-3-  تشریح موشها…………………….. 30

شکل 3-3- توالی ژن pfk-1…………………….. 34

شکل 4-3- دستگاه اسپکتوفتومتری……………… 39

شکل 5-3 دستگاه PCR  (Eppendorf –mastercyc gradient)…….. 44

شکل 6-3 دستگاه الکتروفورز وعکس ژل………….. 48

شکل 7-3 دستگاه Real-Time PCR………………….. 49

شکل 1-4- فراوانی موشهای مورد مطالعه………… 54

شکل 2-4- اثر مصرف عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر وزن موشهای صحرایی………………………………….. 55

شکل 3-4- اثر مصرف عصاره هیدروالکلی برگ گیاه جغجغه بر گلوکز ناشتای موشهای صحرایی……………………… 57

شکل 5-4- نتایج استخراج Total RNA……………… 59

شکل 6-4- تکثیر قطعه (bp190)مربوط به ژن PFK….. 60

شکل7-4- تکثیر قطعه (bp126) مربوط به ژن TBP.….. 60

شکل 8-4- نتایج شیب دمایی PCR  برای ژن  PFK…….. 61

شکل 9-4- نتایج شیب دمایی  PCR برای ژن TBP………. 62

شکل 10-4- منحنی استاندارد ژن  TBP…………… 63

شکل11-4- منحنی استاندارد ژنPFK…………….. 64

شکل 12-4- منحنی تکثیرژن PFK……………….. 65

شکل 13-4- منحنی تکثیرژن TBP……………….. 66

شکل 14-4 تغییرات فلورسانت بر حسب دما برای ژن TBP و PFK    68

شکل 15-4- منحنی ذوب ژن PFK و TBP…………… 69

شکل 16-4- عکس ژل  برای ژن PFK1 نتایج حاصل از real- tim PVR    70

شکل 16-4- تغییرات بیان ژن TBP……………… 70