بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب FGFR2b و بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش با فلزات سمی فهرست اختصارات

فهرست شکل ها و جداول:

شکل 1 : نحوه عملکرد کلی FGF و FGFR

شکل 2 : گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع 2

شکل 3 : ساختمان کلی RTK و انواع FGFR

شکل 4 : ساختمان اصلی یک اسید آمینه

شکل 5 : ساختمان اول، دوم، سوم و چهارم پروتئین

شکل 6 : دسته بندی گیرنده های تیروزین کینازی

شکل 7 : ساختار فاکتورهای رشد فیبروبلاست

شکل 8 : ساختار کریستالی کمپلکس FGF10–FGFR2b

شکل 9 : ا گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی و نواحی فسفریله شدن آن

شکل 10 : برخی از بیماریها و موتاسیون های نقطه ای پاتولوژیک گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی

شکل 11 : مسیر پیام رسانی گیرنده های فاکتور های رشد فیبروبلاستی

شکل 12 : مسیر پیام رسانی Ras/MAPK

شکل 13 : مسیر پیام رسانی  PLCy/Ca+2

شکل 14: مسیر پیام رسانی  PI3-K/Akt

شکل 15: مسیر سیگنالینگ ROS

شکل 16: پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن

شکل 17 : مسیر فسفاتیدیل اینوزیتول-3 کیناز

شکل 18 : فاکتور رونویسی القاء شده 1

شکل 19: مسیر سیگنالینگ NF-kB

شکل 20 : فاکتور هسته ای فعال کننده سلول T

شکل 21: مسیر پیام رسانی AP-1

شکل 22 : عملکرد رسپتور NMDAR و فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز

شکل 23: اثر کادمیوم بر مسیر سیگنالینگ

شکل 24: انواع مسیرهای سیگنالینگ MAPK

شکل 25: اثر نیکل بر مسیر سیگنالینگ

شکل 26: آبشار سیگنالینگ فسفولیپید

شکل 27: ساختار شیمیایی اسیدآمینه های تیروزین ، تریپتوفان و فنیل آلانین

شکل 28: دیاگرام جابلونسکی

شکل 29: دناتوراسیون پروتئین

شکل 30: ساختار شیمیایی اوره و گوانیدین هیدروکلراید

شکل 31: پروتئین های نوترکیب و مزایا

شکل 32: استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین

شکل 33: توالی ژنی ناحیه کینازی و نقشه شماتیک از پلاسمید pLEICS–01

شکل 34: شمای کلی از روش ترانسفورماسیون

شکل 35: روش انجام SDS–PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین

شکل 36: تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی

شکل 37: اسپکتروفلوریمتری Cary مدل Bio700 (Spectrofluorimetry)

شکل 38: اسپکتروسکوپی CD مدلJasco – J810  Circular dichroism spectroscopy))

شکل 39: اسپکتروسکوپی FTIR مدل (Infrared spectroscopy) Perkin-Elmer Spectrum RXI

شکل 40: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coli در دمای 37 درجه سانتی گراد

شکل 41: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری  E.coliدر دمای 20 درجه سانتی گراد

شکل 42: مقایسه‏ی حلالیت ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در دو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد

شکل 43: خالص‏سازی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی حاوی Ni²+-NTA

شکل 44: نتایج SDS-PAGE بعد از دیالیز

شکل 45: بررسی عملکرد ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b خالص شده

شکل 46: بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین  کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از دستگاه CD

شکل 47: بررسی تاثیر سرب بر پروتئین مورد نظر در دستگاه FTIR

شکل 48: بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b

شکل 49: بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b

شکل 50: بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b

جدول 1: جدول متغیرها

جدول2: خصوصیات فلوئورسنس اسیدآمینه های آروماتیک

جدول 3: رنج نرمال و سمی فلزات سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل در مایعات بدن.

فهرست مطالب

فصل اول     مقدمه و اهمیت موضوع. 3

1-1- مقدمه 4

1-1-1- فاکتور رشد فيبروبلاستي. 4

1-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست.. 4

1-1-3- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست نوع 2. 5

1-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی.. 6

1-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون. 8

1-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق. 9

1-3- اهداف طرح 9

1-3-1- هدف اصلی. 9

1-3-2- اهداف فرعی. 9

1-3-3- اهداف کاربردی.. 10

1-3-4- فرضیات.. 10

1-3-5- متغییرها 10

فصل دوم      مروری بر متون گذشته. 11

2-1- پروتئین 12

2-1-1- ساختمان پروتئين ها 13

2-1-2- گیرنده های تیروزین کینازی.. 17

2-1-3- فاکتورهای رشد فیبروبلاستی. 18

2-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی. 20

2-1-5- گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی و اختلالات پاتولوژیکی. 22

2-1-6- مسیر پیام رسانی سلولی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی. 25

2-1-7- تنظیم مسیر پیام رسانی فاکتور های رشد فیبروبلاستی. 29

2-2- فلز چیست؟ 31

2-2-1- فلزات سمی. 31

2-2-3- سرب.. 32

2-2-4-کادمیوم 32

2-2-5- نیکل. 33

2-2-6-آلومینیوم 33

2-7- تاثیر فلزات بر مسیرهای سیگنالینگ. 34

2-7-1-ROS. 34

2-7-2- MAPK.. 35

2-7-3- PI3K/Akt 36

2-7-4- HIF. 37

2-7-5- NF-kB.. 38

2-7-6- NFAT. 39

2-7-7- AP. 40

2-8- اثر ترکیبات فلزی بر مسیرهای سیگنالینگ و بیان ژن 41

2-8-1- سرب.. 41

2-8-2- کادمیوم 43

2-8-3- نیکل. 46

2-8-4- آلومینیوم 48

2-9- پيشگويي ساختمان پروتئين ها 50

2-9-1- بررسی ساختار پروتئین ها 50

2-9-2- مطالعه ی ساختاری پروتئین ها 51

2-9-3- تکنیک های مطالعه ی ساختار پروتئین  ها 52

2-9-4- تکنیک فلوئورسانس اسپکتروسکوپی. 53

2-9-5- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD) 56

2-9-6- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون. 57

2-10- تکنیک های تولید و تخلیص پروتئین های نوترکیب. 60

2-10-1- كاربرد پروتئين هاي نوتركيب. 60

2-10-2- پروتئین های نوترکیب (Recombinant proteins ) 60

2-10-3- توليد پروتئين های نوترکيب در گياهان. 63

2-10-4- استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین. 64

2-10-5- خالص سازی پروتئین های نوترکیب.. 64

فصل سوم   مواد و روش ها. 66

3-1- مواد، تجهیزات و متغیر ها ی آزمایش. 67

3-1-1- مواد مورد استفاده در آزمایش.. 67

3-1-2- دستگاه ها و تجهزات مورد استفاده در آزمایش.. 68

3-2- محلول ها و بافرها 69

3-2-1- تهیه ی استوک آمپی سیلین. 69

3-2-2- تهیه ی استوک IPTG.. 70

3-2-3- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت بررسی حلالیت پروتئین. 70

3-2-4- تهیه ی بافر لیز کننده  سلول جهت تخلیص پروتئین. 70

3-2-5- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 4%… 70

3-2-6- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 12%… 71

3-2-7- تهیه ی محلول  APS10%… 71

3-2-8- تهیه ی بافر الکترود x10  (Running buffer) 71

3-2-9- تهیه ی بافر نمونه Sample Buffer)) 71

3-2-10- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/0 مولار. 72

3-2-11- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/1 مولار. 72

3-2-12- تهیه ی Staining Buffer 72

3-2-13- تهیه ی Destaining Buffer 73

3-2-14- تهیه ی محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید 73

3-2-15- تهیه بافر SDS. 73

3-2-16- تهیه بافرA (Washing Buffer) 73

3-2-17- تهیه بافر B (   (Eluting Buffer 74

3-2-18- تهیه بافر دیالیز. 74

3-2-19- تهیه استوک گوانیدین هیدروکلراید (GnHCl) 74

3-2-20- تهیه استوک فلزات.. 74

3-2-21- آماده سازی محیط های کشت باکتری.. 74

3-3- روش انجام کار 75

3-3-1- نمایش ساختار پلاسمید نوترکیب pLEICS-01 و توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b. 75

3-3-2- مراحل تولید پروتئین نوترکیب.. 77

3-3-3- تعیین غلظت پروتئین. 83

3-3-4- مطالعات اسپکتروسکوپی فلوئورسانس.. 83

3-3-5- مطالعات اسپکتروسکوپی دورنگ نمایی حلقوی CD)) 85

3-3-6- مطالعات اسپکتروسکوپی FTIR.. 86

3-3-7- مطالعات دناتوراسیون شیمیایی با استفاده از اسپکتروسکوپی فلوئورسانس.. 87

         فصل چهارم یافته ها و نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………. …………………………………………………………………………………………………………………………………. 88

4-1- بررسی بیان پروتئین در دمای 37 درجه سانتی گراد 88

4-2- بررسی بیان پروتئین در دمای20 درجه سانتی گراد 89

4-3- بررسی  حلالیت پروتئین بیان شده دردو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد 90

4-4- بررسی میزان خلوص پروتئین محلول شده 91

4-5- آنالیز SDS-PAGE بعد از دیالیز 92

4-6- بررسی عملکرد پروتئین خالص شده 93

4-7- بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 94

4-8- بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 98

4-9- بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 101

4-10- بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 104

فصل پنجم      بحث و نتیجه گیری.. 109

5-1- بحث و نتیجه گیری. 110

فهرست منابع: 116

….………………………………………………………………………………..Abstract