دانلود پروژه:بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی وکیلیت کنندگی آهن و اثرات ضد سرطانی گیاهان دارویی مختلف بر رده های سلولی سرطانی HT-29، A-549 و MCF-7 و مقایسه کیلیتورهای گیاهی با کیلیتورهای سنتزی دفراسیروکس و دفریپرون در دفع فلزات آهن و سرب در مدل بیولوژیکی

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                               صفحه

فصل اول: مقدمه  

1-1 سمیت……………………………………………………………………………………………………………………..1

1-2 ضرورت و سمیت عناصر……………………………………………………………………………………………..1

1-3 سرب در طبیعت…………………………………………………………………………………………………………2

1-3-1 مصارف صنعتي ترکيبات معدني سرب و سرب فلزي……………………………………………….2

1-3-2 مسمومیت با سرب……………………………………………………………………………………………2

1-3-3 نشانه هاي باليني مسموميت از سرب……………………………………………………………………..3

1-3-4 روشهای اندازه گیری سرب……………………………………………………………………………….3

1-4 ترانسفرین…………………………………………………………………………………………………………………4

1-5 آهن………………………………………………………………………………………………………………………..4

1-5-1 ترکيبات آهن …………………………………………………………………………………………………5

1-5-2 فراواني………………………………………………………………………………………………………….5

1-5-3 جذب آهن و توزيع آن……………………………………………………………………………………..5

1-5-4 مقدار آهن مورد نياز بدن……………………………………………………………………………………7

1-5-5 نقش آهن در بدن و اثرات آن بر سلامت انسان……………………………………………………….7

1-5-6 مسموميت با آهن……………………………………………………………………………………………..7

1-5-7 فعالیت ردکس آهن و استرس اکسیداتیو……………………………………………………………….8

1-6 سرطان……………………………………………………………………………………………………………………..9

1-6-1 آهن و سرطان ……………………………………………………………………………………………….10

1-7 کیلیت درمانی………………………………………………………………………………………………………….11

1-7-1 لیگاندهای کیلیت کننده ………………………………………………………………………………….11

1-7-2 کیلیتور دفراسیروکس (Exjade) ………………………………………………………………………12

1-7-3 کیلیتور دفریپرون (L₁) ……………………………………………………………………………………14

1-7-4 عملکرد کیلیتورها در درمان سرطان …………………………………………………………………..15

1-7-5 عوارض کیلیتورهای سنتزی …………………………………………………………………………….16

1-8 کیلیتور طبیعی …………………………………………………………………………………………………………16

1-8-1 انار …………………………………………………………………………………………………………….17

1-8-2 پسته ……………………………………………………………………………………………………………18

1-8-3 شلغم …………………………………………………………………………………………………………..19

1-9 فیتوشیمی ……………………………………………………………………………………………………………….20

1-9-1 آلکالوئید …………………………………………………………………………………………………….21

1-9-2 تانن …………………………………………………………………………………………………………… 21

1-9-3 فلاونوئید ……………………………………………………………………………………………………..22

1-10 عصاره …………………………………………………………………………………………………………………22

1-10-1 روشهای مختلف عصاره گیری ……………………………………………………………………….23

1-11 میزان فنولیک کل …………………………………………………………………………………………………24

1-12 رادیکال آزاد ……………………………………………………………………………………………………….25

1-13 آنتی اکسیدان………………………………………………………………………………………………………..27

1-13-1 مفهوم آنتی اکسیدان …………………………………………………………………………………….27

1-13-2 فرایند آنتی اکسیدانی ……………………………………………………………………………………28

1-13-3 سیستم آنتی اکسیدانی موجود زنده ………………………………………………………………….28

1-13-4 انواع آنتی اکسیدانها …………………………………………………………………………………….30

 1-13-5 روشهای سنجش فعالیت آنتی اکسیدانی …………………………………………………………..32

1-13-5-1 سنجش مهار رادیکال آزاد DPPH ……………………………………………………….33

1-13-5-2 سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی تام ………………………………………………………..34

1-14 فعالیت کیلیت کنندگی فلزات ………………………………………………………………………………….35

1-15 سمیت سلولی و اثرات ضد سرطانی ……………………………………………………………………………37

1-15-1 تکنیک MTT …………………………………………………………………………………………….38

1-15-2 رده سلولی A549 …………………………………………………………………………………39

1-15-3 رده سلولی HT29  …………………………………………………………………………………39

1-15-5 رده سلولی MCF-7 ………………………………………………………………………………39

1-16 دستگاه تبخیر روتاری …………………………………………………………………………………………….39

1-17 طیف سنجی مرئی- فرابنفش …………………………………………………………………………………. 40

1-18 اسپکتروسکوپي جذب اتمي …………………………………………………………………………………….40

فصل دوم: بخش تجربی

2-1 وسایل مورد استفاده ………………………………………………………………………………………………….43

2-2 مواد شیمیایی مورد استفاده …………………………………………………………………………………………43

2-3 گیاهان دارویی مورد استفاده ………………………………………………………………………………………44

2-4 رده های سلولهای سرطانی مورد بررسی ………………………………………………………………………..44

2-5 عصاره گیری ………………………………………………………………………………………………………….45

2-6 جداسازی جزء به جزء عصاره های متانولی پوست و پالپ انار ……………………………………………46

2-7 آزمون فیتوشیمیایی مقدماتی ………………………………………………………………………………………47

2-7-1 شناسایی وجود تانن ……………………………………………………………………………………….47

2-7-2 شناسایی وجود فلاونوئید …………………………………………………………………………………47

2-7-3 شناسایی وجود آلکالوئید ………………………………………………………………………………..48

2-7-4 شناسایی وجود ساپونین …………………………………………………………………………………..49

2-8 میزان فنولیک کل ……………………………………………………………………………………………………50

2-8-1تهیه محلولهای مورد نیاز ………………………………………………………………………………….50

2-8-1-1 تهیه محلول عصاره های مختلف …………………………………………………………….50

2-8-1-2 تهیه ی محلول کربنات سدیم………………………………………………………………….50

2-8-1-3 تهیه محلول معرف فولین سیوکالتو…………………………………………………………..50

2-8-1-4 تهیه غلظتهای مختلف اسید گالیک به عنوان استاندارد………………………………….50

2-8-2 روش کار …………………………………………………………………………………………………….50

2-9 سنجش خواص آنتی اکسیدانی……………………………………………………………………………………51

2-9-1 سنجش فعالیت آنتی اکسیدانی با مهار رادیکال DPPH…………………………………………..51

2-9-1-1 تهیه محلولهای مورد نیاز………………………………………………………………………..51

2-9-1-1-1 تهیه محلول DPPH………………………………………………………………………….51

2-9-1-1-2 تهیه محلول غلظتهای مختلف نمونه های مورد مطالعه……………………………….51

2-9-1-2 روش کار ………………………………………………………………………………………………..51

2-9-2 سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی کل با روش FRAP …………………………………………………….52

2-9-2-1تهیه محلولهای مورد نیاز ………………………………………………………………………………52

2-9-2-1-1 تهیه ی بافر استات ……………………………………………………………………………52

2-9-2-1-2 تهیه ی محلول اسید کلریدریک …………………………………………………………52

2-9-2-1-3 تهیه ی محلول TPTZ ………………………………………………………………………52

2-9-2-1-4 تهیه محلول کلرید آهن (II) ………………………………………………………………53

2-9-2-1-5 تهیه محلول نمونه …………………………………………………………………………….53

2-9-2-1-6 تهیه غلظتهای مختلف از سولفات آهن………………………………………………….53

2-9-2-1-7 تهیه محلول FRAP …………………………………………………………………………53

2-9-2-2 روش کار ………………………………………………………………………………………………..53

2-10 سنجش فعالیت کیلیت کنندگی آهن…………………………………………………………………………..53

2-10-1  تهیه محلول های مورد نیاز……………………………………………………………………………..53

2-10-1-1  تهیه محلول سدیم استات…………………………………………………………………….53

2-10-1-2 تهیه محلول کلرید آهن (II) ………………………………………………………………..54

2-10-1-3 تهیه معرف فروزین…………………………………………………………………………….54

2-10-1-4  تهیه غلظتهای مختلف نمونه های مورد مطالعه………………………………………….54

2-10-2 روش کار…………………………………………………………………………………………………..54

2-11 بررسی اثرات ضد سرطانی و سمیت سلولی…………………………………………………………………..55

2-11-1 تهیه محلولهای مورد نیاز………………………………………………………………………………..55

2-11-1-1تهیه بافر PBS ……………………………………………………………………………………55

2-11-1-2 تهیه رنگ تریپان بلو……………………………………………………………………………55

2-11-1-3 تهیه محلول MTT……………………………………………………………………………..55

2-11-2 از انجماد خارج کردن سلولها………………………………………………………………………….55

2-11-3 کشت سلول ……………………………………………………………………………………………….56

2-11-4 واکشت دادن سلول (پاساژ دادن) …………………………………………………………………….56

2-11-5 روش استفاده از هموسیتومتر برای شمارش سلول ها……………………………………………..57

2-11-6 سنجش اثرات ضد سرطانی با تکنیک MTT………………………………………………………57

2-12 مطالعات درون تنی (in vivo)……………………………………………………………………………………58

2-12-1 حیوانات آزمایشگاهی مورد استفاده در مطالعه اضافه بار آهن…………………………………58

2-12-1-1 نحوه ی ایجاد اضافه بار آهن در موشهای آزمایشگاهی………………………………58

2-12-1-2 تهیه محلولهای مورد نیاز……………………………………………………………………..59

2-12-1-2-1 تهیه محلول عصاره تام و جزء اتیل استاتی …………………………………….59

2-12-1-2-2 تهیه محلول دفراسیروکس ………………………………………………………..59

2-12-1-3 تحقيقات انجام شده بر روي حيوانات آزمايشگاهي …………………………………..59

2-12-1-4 گروه بندي موش هاي آزمايشگاهي………………………………………………………59

2-12-1-5 نمونه برداري از گروه هاي مختلف موش هاي تحت رژيم…………………………..60

2-12-1-6 آماده سازي نمونه هاي گرفته شده از موش هاي آزمايشگاهي……………………..60

2-12-1-7 اندازه گيري آهن توسط دستگاه جذب اتمي شعله…………………………………….61

2-12-2 حیوانات آزمایشگاهی مورد استفاده در مطالعه اضافه بار سرب……………………………….61

2-12-2-1 نحوه ی ایجاد اضافه بار سرب در موشهای آزمایشگاهی……………………………..61

2-12-2-2 تهیه محلولهای مورد نیاز ……………………………………………………………………..61

2-12-2-2-1 تهيه محلول سرب(II) ………………………………………………………………61

2-12-2-2-2 تهیه ی محلول عصاره ی تام وجزء اتیل استاتی……………………………….62

2-12-2-2-3 تهيه محلول دفریپرون (L₁) ……………………………………………………….62

2-12-2-2-3 تهيه محلول دفراسیروکس (Exjade ) …………………………………………62

2-12-2-3 تحقيقات انجام شده بر روي حيوانات آزمايشگاهي …………………………………..62

2-12-2-4 گروه بندي موش هاي آزمايشگاهي………………………………………………………62

2-12-2-5 نمونه برداري از گروه هاي مختلف موش هاي تحت رژيم…………………………..63

2-12-2-6 آماده سازي نمونه هاي گرفته شده از موش هاي آزمايشگاهي……………………..64

2-12-2-7 اندازه گيري سرب در بافتهای مختلف توسط دستگاه جذب اتمي شعله………….64

2-12-2-8  اندازه گيري آهن توسط دستگاه جذب اتمي شعله……………………………………64

2-13 روش محاسبه، تجزیه و تحلیل داده ها………………………………………………………………………….65

فصل سوم: نتایج و تفسیر آنها

بخش اول: نتایج حاصل از سنجش محتوی فنولیک، فعالیت آنتی اکسیدانی و کیلیتوری گیاهان دارویی مورد مطالعه بصورت عصاره تام

3-1-1 درصد عصاره بدست آمده با روش خیساندن…. ………………………………………………………….68

3-1-2 آزمون فیتوشیمیایی مقدماتی …………………………………………………………………………………..68

3-1-3 نتایج حاصل از سنجش میزان ترکیبات فنولیک در عصاره های تام ………………………………….69

3-1-3-1 منحنی کالیبراسیون جهت اندازه گیری گالیک اسید…………………………………………..69

3-1-3-2 میزان ترکیبات فنولیک کل (TPC) موجود در عصاره های تام ……………………………69

3-1-4 نتایج حاصل از سنجش عصاره های تام در مهار رادیکال DPPH ……………………………………70

3-1-4-1 سنجش خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره ی تام آب انار……………………………………….70

3-1-4-2 سنجش خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره ی تام دانه انار ……………………………………….71

3-1-4-3 سنجش خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره ی تام پالپ انار………………………………………72

3-1-4-4 سنجش خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره ی تام پوست انار……………………………………72

3-1-4-5 سنجش خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره ی تام پوست پسته ………………………………….73

3-1-4-6 سنجش خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره ی تام مغز پسته………………………………………74

3-1-4-7 سنجش خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره ی تام شلغم تازه…………………………………….74

3-1-4-8 سنجش خاصیت آنتی اکسیدانی عصاره ی تام شلغم خشک شده………………………….75

3-1-5  سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی کل …………………………………………………………………………76

3-1-5-1 منحنی کالیبراسیون جهت اندازه گیری سولفات آهن (II) …………………………………..76

3-1-5-2 سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی کل موجود در عصارهای تام……………………………….76

3-1-6 سنجش فعالیت کیلیت کنندگی آهن………………………………………………………………………..77

3-1-6-1 اندازه گیری فعالیت کیلیتوری عصاره تام آب انار……………………………………………. 78

3-1-6-2 اندازه گیری فعالیت کیلیتوری عصاره تام دانه انار ……………………………………………. 79

3-1-6-3 اندازه گیری فعالیت کیلیتوری عصاره تام پالپ انار…………………………………………… 79

3-1-6-4 اندازه گیری فعالیت کیلیتوری عصاره تام پوست انار ……………………………………….. 80

3-1-6-5 اندازه گیری فعالیت کیلیتوری عصاره تام پوست پسته……………………………………….. 81

3-1-6-6 اندازه گیری فعالیت کیلیتوری عصاره تام مغز پسته…………………………………………… 81

3-1-6-7 اندازه گیری فعالیت کیلیتوری عصاره تام شلغم تازه…………………………………………..82

3-1-6-8 اندازه گیری فعالیت کیلیتوری عصاره تام شلغم خشک شده………………………………..83

3-1-7  ارتباط بین محتوی فنولیک کل موجود در عصاره با فعالیت کیلیتوری و آنتی اکسیدانی ………83

3-1-8  ارتباط بین توانایی کیلیت کنندگی عصاره تام و فعالیت آنتی اکسیدانی ……………………………86

3-1-9 مقایسه نتایج حاصل از سنجش توانایی کیلیتوری و خواص آنتی اکسیدانی عصاره های تام مورد مطالعه و انتخاب عصاره موثر……………………………………………………………………………………………..86

بخش دوم: نتايج حاصل از سنجش فعالیت آنتي اکسیداني و کیلیتوري اجزاء مختلف بدست آمده از عصاره هاي تام پوست و پالپ انار و انتخاب جزء موثر

3-2-1 راندمان اجزاء بدست آمده……………………………………………………………………………………..90

3-2-2 نتایج حاصل از سنجش میزان ترکیبات فنولیک در اجزاء مختلف……………………………..90

3-2-2-1 منحنی کالیبراسیون جهت اندازه گیری گالیک اسید……………………………………90

3-2-2-2 میزان ترکیبات فنولیک  کل (TPC) موجود در اجزاء مختلف……………………….91

3-2-3 نتایج حاصل از سنجش اجزاء مختلف در مهار رادیکال DPPH ……………………………….92

3-2-3-1 سنجش خاصیت آنتی اکسیدانی اجزاء حاصل از عصاره پوست انار…………………92

3-2-3-2 سنجش خاصیت آنتی اکسیدانی اجزاء حاصل از عصاره پالپ انار…………………..95

3-2-4 سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی کل با استفاده از تکنیک FRAP ………………………………97

3-2-4-1 منحنی کالیبراسیون جهت اندازه گیری سولفات آهن (II)…………………………….97

3-2-4-2 سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی کل موجود در اجزاء مختلف…………………………98

3-2-5 سنجش فعالیت کیلیت کنندگی آهن………………………………………………………………….99

3-2-5-1 نتایج اندازه گیری فعالیت کیلیتوری دفریپرون (کیلیتور سنتزی)……………………..99

3-2-5-2 نتایج اندازه گیری فعالیت کیلیتوری اجزاء حاصل از عصاره پوست انار……………99

3-2-5-3 نتایج اندازه گیری فعالیت کیلیتوری اجزاء حاصل از عصاره پالپ انار…………….102

3-2-6 ارتباط بین محتوی فنولیک کل موجود در فراکسیونهای با فعالیت کیلیتوری و آنتی اکسیدانی……………………………………………………………………………………………………………..104

3-2-7 ارتباط بین توانایی کیلیت کنندگی اجزاء و فعالیت آنتی اکسیدانی…………………………..106

3-2-8  مقایسه نتایج و انتخاب جزء موثر……………………………………………………………………..106

3-2-8-1 مقایسه نتایج بدست آمده از اجزاء حاصل از عصاره پوست انار…………………….106

3-2-8-2 مقایسه نتایج بدست آمده از اجزاء حاصل از عصاره پالپ انار……………………….107

بخش سوم: نتايج ارزيابي اثرات ضدسرطاني عصاره هاي تام و اجزاء اتیل استاتي پوست و پالپ انار بعنوان کیلیتور گیاهي و دفريپرون بعنوان کیلیتور سنتزي

3-3-1 نتايج سمیت سلولي و اثر ضد سرطاني نمونه هاي مورد مطالعه……………………………………110

3-3-1-1 نتایج سمیت سلولی نمونه های مورد مطالعه بر رده سلولی A549…………………………110

3-3-1-2 نتایج سمیت سلولی نمونه های مورد مطالعه بر رده سلولی HT29………………………..112

3-3-1-3 نتایج سمیت سلولی نمونه های مورد مطالعه بر رده سلولی MCF7……………………….114

3-3-2  ارتباط بین توانایی کیلیت کنندگی آهن و اثر ضد سرطانی در سلولهای سرطانی مختلف……116

3-2-3 مقایسه نتایج اثرات سمیت سلولی نمونه های مورد مطالعه بر رده های سلولی A549، HT29 و MCF7………………………………………………………………………………………………………………………117

بخش چهارم: نتايج حاصل از سمیت آهن و سنجش عمکرد عصاره هاي تام و اجزاء اتیل استاتي پوست و پالپ انار در کیلیت آهن در بدن موجود زنده در مقايسه با کیلیتور سنتزي دفراسیروکس

3-4-1 علائم ظاهري ناشي از اضافه بار آهن در بدن موشهاي آزمايشگاهي……………………………121

3-4-2 منحني کالیبراسیون جهت اندازه گیري آهن به روش اسپکتروسکوپي جذب اتمي…………121

3-4-3 نتايج حاصل از اندازه گیري آهن در بافتهاي مختلف بدن موشهاي آزمايشگاهي…………..122

3-4-3-1 نتايج اندازه گیري میزان آهن در بافت کبد…………………………………………………..122

3-4-3-2 نتايج اندازه گیري میزان آهن در بافت طحال………………………………………………..125

3-4-3-3 نتايج اندازه گیري میزان آهن در بافت کلیه………………………………………………….126

3-4-3-4 نتايج اندازه گیري میزان آهن در بافت قلب………………………………………………….128

3-4-3-5 نتايج اندازه گیري میزان آهن در بافت ريه……………………………………………………130

3-4-3-6 نتايج اندازه گیري میزان آهن در بافت روده…………………………………………………132

3-4-4 مقايسه میزان تجمع آهن در بافتهاي مختلف و عملکرد کیلیتورهاي گیاهي در دفع آن……134

بخش پنجم: نتايج حاصل از سمیت سرب و سنجش عملکرد کیلیتورهاي گیاهي در مقايسه با کیلیتورهاي دفراسیروکس و دفريپرون در دفع سرب از بدن موجود زنده

3-5-1 علائم ظاهري ناشي از ورود سرب به بدن موشهاي آزمايشگاهي…………………………………136

3-5-2 منحني کالیبراسیون جهت اندازه گیري سرب………………………………………………………….136

3-5-3 نتايج حاصل از اندازه گیري سرب در بافتهاي مختلف بدن موشهاي آزمايشگاهي………….137

3-5-3-1 نتايج اندازه گیري میزان سرب در بافت قلب………………………………………………..138

3-5-3-2 نتايج اندازه گیري میزان سرب در بافت کلیه ……………………………………………….140

3-5-3-3 نتايج اندازه گیري میزان سرب در بافت کبد…………………………………………………142

3-5-3-4 نتايج اندازه گیري میزان سرب در بافت طحال………………………………………………144

3-5-3-5 نتايج اندازه گیري میزان سرب در بافت روده………………………………………………..146

3-5-4 مقايسه میزان تجمع سرب در بافتهاي مختلف و عملکرد کیلیتورهاي گیاهي در دفع آن ….148

3-5-5 اندازه گیري آهن بافتهاي مختلف موشهاي آزمايشگاهي…………………………………………..149

3-5-5-1 منحني کالیبراسیون جهت اندازه گیري آهن…………………………………………………149

3-5-5-2 نتايج حاصل از اندازه گیري آهن بافتهاي مختلف در گروه تحت رژيم سرب با دوز پايین……………………………………………………………………………………………………………………150

3-5-5-3 نتايج حاصل از اندازه گیري آهن بافتهاي مختلف در گروه تحت رژيم سرب با دوز بالا………………………………………………………………………………………………………………………152

فصل چهارم: نتیجه گیری

4-1 تفسیر نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنتی اکسیدانی و کیلیتوری عصاره های تام …………………155

4-2 تفسیر نتايج حاصل از سنجش فعالیت آنتي اکسیداني، کیلیتوري اجزاء مختلف حاصل از پوست و پالپ انار………………………………………………………………………………………………….158

4-3 نتايج حاصل از سنجش اثر ضد سرطاني دفريپرون، جزء اتیل استاتي و عصاره هاي تام پوست و پالپ انار بر رده هاي سلولي A-549 ، HT-29 و MCF-7…………………………………………….160

4-4 نتايج حاصل از عملکرد کیلیتورهاي گیاهي در مقايسه با کیلیتور سنتزي دفراسیروکس در کیلیت آهن (مطالعه درون تني(in vivo…………………………………………………………………………..162

4-5 نتايج حاصل از عملکرد کیلیتورهاي گیاهي در مقايسه با کیلیتورهاي سنتزي دفراسیروکس و ذفريپرون در کیلیت سرب (مطالعه درون تنی in vivo)……………………………………………………….164

فهرست منابع …………………………………………………………………………………………………………..167