بررسی فراوانی ژن‌های حدّت در باکتری‌‌های سودوموناس آئروژینوزا جدا شده از بیماران مبتلا به سوختگی و فيبروز سيستيك بستري در بيمارستان کودکان تهران

فهرست مطالب

عنوان…………………………………………… صفحه

فصل اول– مقدمه…………………………………… 7

فصل دوم- كليات…………………………………… 9

2-1- خصوصيات جنس سودوموناس………………………… 9

2-1-1- طبقه بندي سودوموناس‌ها………………………. 10

2-1-2-روش‌هاي تيپ‌بندي……………………………… 11

2-1-2-1- تيپ‌بندي بر اساس باكتريوسين………………… 12

2-1-2-2- تيپ‌بندي بر اساس سرولوژي……………………. 12

2-1-2-3- تيپ‌بندي بر اساس آناليز محدوديت اسيد نوكلئيك…. 12

2-1-3- زيستگاه طبيعي……………………………… 12

2-1-4- مورفولوژي و ساختمان سلولي سودوموناس آئروژينوزا… 12

2-1-4-1- غشاء سيتوپلاسمي…………………………… 13

2-1-4-2- غشاء خارجي………………………………. 13

2-1-4-3- پروتئين‌هاي غشاءخارجي……………………… 14

2-1-4-4- فضاي پري‌پلاسم و پپتيدوگليكان……………….. 14

2-1-4-5- فلاژل……………………………………. 15

2-1-4-6- فيمبريه…………………………………. 16

2-1-5- درجه حرارت وPH مناسب……………………….. 17

2-1-6- پراكندگي سودوموناس آئروژينوزا……………….. 17

2-1-7- متابوليسم…………………………………. 18

2-1-8- پيگمان‌ها………………………………….. 18

2-1-9- خصوصيات کشت و انواع کلنی……………………. 19

2-1-10- محيطهاي انتخابي و مواد آلي مورد نياز………… 19

2-1-11- ويژگيهاي بيوشيميائي سودوموناس آئروژينوزا…….. 20

2-1-11-1- واكنش‌هاي هيدروليتيك……………………… 20

2-1-11-2- واكنش‌هاي اكسيداسيون كربوهيدراتها………….. 20

2-1-11-3- واكنش‌هاي احياء نيترات و شوره برداري……….. 20

2-1-11-4- واكنش‌هاي تجزيه تركيبات آروماتيك…………… 20

2-1-11-5- واكنش‌هاي اكسيداز و كاتالاز………………… 20

2-1-11-6- واكنش‌هاي دكربوكسيلاز……………………… 21

2-1-11-7- واكنش آرژينين دهيدرولاز…………………… 21

2-1-12- پاتوژنز و شاخص‌های حدت در سودوموناس آئروژينوزا… 21

2-1-12-1- پيوسيانين………………………………. 21

2-1-12-2- سيدروفورها……………………………… 21

2-1-12-3-هموليزين‌ها………………………………. 21

2-1-12-4- ليپازها………………………………… 22

2-1-12-5- پروتئازها………………………………. 22

2-1-12- 6- سیستم ترشحی تیپ lll………………………. 22

2-1-12- 7- توکسين‌هاي خارج سلولي……………………. 23

2-1-12-8- اندوتوکسين……………………………… 23

2-1-12-9- الاستین…………………………………. 23

2-1-12-10- آلژینات……………………………….. 25

2-1-13- بيماريزايي تجربي………………………….. 28

2-2- اپيدميولوژی…………………………………. 28

2-3- کروم سنسينگ…………………………………. 29

 فصل سوم-مواد و روش‌ها…………………………….. 31

3-1- جمع آوری نمونه‌های بالینی  ……………………. 31

3-2- تائید سویه‌هاي سودوموناس آئروژینوزا جمع‌آوري شده….. 31

3-3- نگهداري سویه‌‌‌هاي تائید شده…………………….. 32

3-3-1- مواد و وسایل مورد نیاز……………………… 32

3-3-2- روش تهیه محیط Skim Milk به همراه پرل‌هاي شیشه‌اي…… 32

3-4- واکنش زنجیره پلي مرازي (PCR)…………………… 32

3-4-1- مواد مورد نیازبرای واکنش PCR…………………. 32

3-4-1-1- آنزیم DNA پلی‌مراز………………………… 33

3-4-1-2- پرایمرها………………………………… 33

3-4-1-3- داکسی ریبونوکلئوتیدتري فسفات (dNTPs)………… 34

3-4-1-4- DNA  الگو(Template)…………………………. 34

3-4-1-5- استخراج DNA……………………………… 34

3-4-2- شرایط بافري واکنش……………………………. 35

3-4-3- آنالیز محصول PCR……………………………. 35

3-4-4- مراحل انجام واکنش PCR……………………….. 35

3-4-4-1- مواد و وسایل مورد نیاز……………………. 35

3-4-4-2- روش تهیه DNA الگو(Template)…………………. 36

3-4-4-3- پرایمرهاي مورد استفاده در این طرح………….. 36

3-4-4-4- روش تهیه Master Mix…………………………. 36

3-4-4-5- روش تهیه (dNTPs)………………………….. 37

3-4-4-6-روش تهيه Mixd primer …………………………. 37

3-4-4-7- روش تهیه Taq پلی مراز……………………… 37

3-4-4-8- تهیه و استفاده از Mgcl₂…………………….. 37

3-4-4-9- تنظیم دستگاه ترموسایکلر…………………… 37

3-4-5- الکتروفورز محصول PCR………………………… 38

3-4-5-1- مواد و وسایل لازم…………………………. 38

3-4-5-2-مراحل کار………………………………… 39

3-4-6- مشاهده باندهاي PCR………………………….. 40

3-4-7- نکات مورد توجه PCR………………………….. 40

3-5-کنترل کیفی ………………………………….. 40

فصل چهارم- نتايج…………………………………. 42

4-1- تست‌های تشخیصی سودوموناس آئروژینوزا…………….. 43

4-1-1- كشت بر روي محيط مولر هينتون آگار…………….. 43

4-1-2- كشت بر روي محيط بلاد آگار……………………. 44

4-1-3- كشت بر روي محيط مك كانكي……………………. 45

4-1-4- كشت بر روي محيط TSI…………………………. 46

4-1-5- كشت بر روي محيط OF…………………………. 47

4-1-6- تست اكسيداز……………………………….. 48

4-1-7- رنگ آمیزی گرم……………………………… 49

4-2- بررسی کمی و کیفی DNA استخراج شده………………. 50

فصل پنجم- بحث……………………………………. 56

پيشنهادات……………………………………….. 63

فهرست اشكال

عنوان…………………………………………… صفحه

شكل2-1- سیستم حساسیت جمعیتی (Quarum sensing) سودوموناس آئروژینوزا 25

شكل2-2- سيستم های Quorum sensing در سودوموناس آئروژينوزا…. 30

شكل4-1- کلنی‌های سبز رنگ سودوموناس آئروژینوزا بر روی پلیت مولر هینتون آگار بعد از 24…………………………………… 43

شكل4-2- سودوموناس آئروژینوزا بر روی محیط بلاد آگار حاوی 5 درصد خون گوسفند………………………………………….. 44

شكل4-3- کلنی‌های سودوموناس آئروژینوزا بر روی محیط کشت مک‌کانکی  45

شكل4-4- باکتری سودوموناس آئروژینوزا بر روی محیط کشت TSI.. 46

شكل4-5- سودوموناس آئروژینوزا در محیط OF…………….. 47

شكل4-6- تست اکسیداز سودوموناس آئروژینوزا……………. 48

شكل4-7- رنگ آمیزی گرم سودوموناس آئروژینوزا………….. 49

شكل4-8- گرادیانت دمایی plcN و algD…………………… 50

شكل 4-9- ژن  toxAدر سودوموناس آئروژینوزاهای جدا شده از سوختگی و CF   52

شكل4-10- دو ژن algD و plcN در سودوموناس آئروژینوزاهای جدا شده از سوختگی و CF…………………………………………….. 53

شكل4-11- سه ژن plcH، lasB، exoS در سودوموناس آئروژینوزاهای جدا شده از سوختگی وCF……………………………………….. 54

شكل5-1- فراوانی ژن‌ها در cf و سوختگی…………………. 59

نمودار4-12- مقایسه شیوع ژن‌های حدت در سودوموناس آئروژینوزا 55

 

فهرست جداول

 عنوان………………………………………….. صفحه

جدول1-1- پنج گروه باکتريايی بر اساس همولوژی rRNA…….. 11

جدول2-1- تنظیم پیچیده ژن‌های دخالت کننده در تولید آلژینات 28

جدول3-1– مشخصات بیوشیمیایی سودوموناس آئروژینوزا……… 32

جدول3-2-پرایمرهای مورد نیاز……………………….. 36

جدول3-3- مقدار مواد مورد نیاز برای تهیه Master Mix…….. 37

جدول3-4– برنامه‌ريزي دستگاه ترموسايکلر براي ژن toxA …… 37

جدول3-5- برنامه‌ريزي دستگاه ترموسايکلر براي ژن lasB, plcH, exoS 38

جدول3-6- برنامه‌ريزي دستگاه ترموسايکلر براي ژن algD, plcN …. 38

جدول4-1-تعداد نمونه‌های مثبت و منفی ژن‌های pcr شده سیستیک فیبروزیس    51

جدول4-2-تعداد نمونه‌های مثبت و منفی ژن‌های pcr شده سوختگی.. 51

جدول4-3- مقایسه نتایج حاصل از سیستیک فیبروزیس و سوختگی.. 54