بررسی فراوانی شيوع ژن هایTEM،CTX-M وSHV در کلبسیلاپنومونیا تولیدکننده بتالاکتامازهای وسیع الطیف به روش Multiplex PCRاستادراهنما:

                                                                           فهرست مطالب

-فصل اول: مقدمه و کلیات……………………………………………………………………………………………………………………..1

1-1: مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 2

2-1: خصوصیات عمومی خانواده انتروباکتریاسه. ……………………………………………………………………………………………..3

1-2-1: جنس کلبسیلا……………………………………………………………………………………………………………………………….. 4

2-2-1: گونه های مختلف کلبسیلا………………………………………………………………………………………………………………5

3-2-1:  کلبسیلاپنومونیا …………………………………………………………………………………………………………………………….6

4-2-1: بیماری های ناشی از کلبسیلا پنومونیا ……………………………………………………………………………………………….6

5-2-1: تشخیص کلبسیلا پنومونیا …………………………………………………………………………………………………………………6

6-2-1: درمان بیماری های ناشی از کلبسیلا پنومونیا ………………………………………………………………………………………..7

3-1: آنتی بیوتیک ها ………………………………………………………………………………………………………………………………….7

1-3-1: مقاومت ذاتی (طبیعی) به آنتی بیوتیک ها …………………………………………………………………………………………..8

2-3-1: مقاومت اکتسابی به آنتی بیوتیک ها ………………………………………………………………………………………………….8

3-3-1: مقاومت به بتالاکتام ها ……………………………………………………………………………………………………………………8

4-1: بتالاکتام ها ………………………………………………………………………………………………………………………………………..9

5-1: عمل بتالاکتام ها ………………………………………………………………………………………………………………………………….9

6-1: آنزیم های بتالاکتاماز…………………………………………………………………………………………………………………………10

7-1: الگوی طبقه بندی آنزیم های بتالاکتاماز ……………………………………………………………………………………………….11

8-1: ژنتیک آنزیم های  بتالاکتاماز   ………………………………………………………………………………………………………………..12

1-8-1: TEM

………………………………………………………………………………………………………………………………………….13

2-8-1: ………………………………………………………………………………………….CTX-M 14

3-8-1: SHV …………………………………………………………………………………………………………………………………………..14

9-1: القای مقاومت.. ………………………………………………………………………………………………………………………………….. 15

10-1: اهداف پژوهش.. …………………………………………………………………………………………………………………………….16

11-1: فرضیه های پژوهش..

………………………………………………………………………………………………………………………16

فصل دوم: مروری بر مطالعات انجام شده.. ……………………………………………………………………………………………..17

فصل سوم: مواد و روش ها ………………………………………………………………………………………………………………..23

1-3: مواد و روش ها ………………………………………………………………………………………………………………………………24

2-3: دستگاه های مورد استفاده …………………………………………………………………………………………………………………24

3-3: مواد مورد استفاده ……………………………………………………………………………………………………………………………25

4-3: نمونه گیری.. …………………………………………………………………………………………………………………………………….26

1-4-3: دیسک گذاری …………………………………………………………………………………………………………………………..26

2-4-3: روش انجام تست آنتی بیوگرام ………………………………………………………………………………………………………….26

3-4-3: تست فنوتیپی تاییدی……………………………………………………………………………………………………………………..28

5-3: استخراج DNA ژنومی. …………………………………………………………………………………………………………………………28

1-5-3: مواد مورد نیاز جهت استخراج DNA ژنومی به روش جوشاندن  ………………………………………………………………..28

2-5-3: طرز تهیه PBS 1X (در حجم 1000 میلی لیتر) ……………………………………………………………………………………….28

3-5-3:  مراحل استخراج DNA به روش جوشاندن  …………………………………………………………………………………………….29

4-5-3: کیفیت وکمیت سنجی DNA استخراج شده ……………………………………………………………………………………………30

5-5-3: اسپکتروفتومر. …………………………………………………………………………………………………………………………………….30

6-5-3: طریقه ساخت و روش انجام الکتروفرز با ژل آگارز(ژل افقی)…….……………………………………………………………30

7-5-3: بافرالکتروفروز 5x TAX در حجم 1 لیتر. …………………………………………………………………………………………………31

8-5-3: روش تهیه محلول رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید ………………………………………………………………………………………..32

6-3: طراحی پرایمر ها …………………………………………………………………………………………………………………………………….32

7-3: آماده سازی پرایمر  ها………………………………………………………………………………………………………………………………33

8-3: انجام واکنشPCR   ………………………………………………………………………………………………………………………………….34

9-3: تایید محصولات PCR. ……………………………………………………………………………………………………………………………35

10-3: تعیین توالی. ………………………………………………………………………………………………………………………………………..35

فصل چهارم: نتایج وبحث   ……………………………………………………………………………………………………………………………..36

1-4: نمونه گیری و اطلاعات بیماران ……………………………………………………………………………………………………………….37

2-4: تعیین الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی در ایزوله های کلبسیلا پنومونیا ……………………………………………………………….37

3-4: نتایج تست فنوتیپی تاییدی.. ……………………………………………………………………………………………………………………….39

4-4: نتایج استخراج DNA ژنومی ……………………………………………………………………………………………………………………40

5-4: نتایج PCR شیب دمایی و PCR انجام شده روی ایزوله ها…….. ………………………………………………………………………40

6-4: فراوانیESBL مثبت ومنفی در نمونه های حساس ونیمه حساس و مقاوم. ……………………………………………………………43

7-4: نتایج آماری …………………………………………………………………………………………………………………………………………44

8-4: نتایج تایید محصولات Multiplex PCR

……………………………………………………………………………………………………45

1-8–4: نتایج تعیین توالی   ……………………………………………………………………………………………………………………………….45

9-4: بحث    ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………47

10-4: نتیجه گیری.. …………………………………………………………………………………………………………………………………………52

منابع. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….53

                                                                                                فهرست جداول

جدول 1-3: دستگاه های مورد استفاده در آزمایش    …………………………………………………………………………………………24

جدول 2-3: مواد مورد استفاده در آزمایش    ……………………………………………………………………………………………………..25

جدول 3-3: طریقه ساخت بافر PBS 1X   ………………………………………………………………………………………………………..29

جدول 4-3:  دستور العمل ساخت بافر TAE 5X   ……………………………………………………………………………………………..32

جدول 5-3: . توالی پرایمر های طراحی شده………………………………………………………………………………………………….33

جدول 6-3: مواد و نسبت­های به کار گرفته شده در واکنشPCR  ……………………………………………………………………………35

جدول1-4: نتایج بررسی مقاومت به آنتی بیوتیک ها ………………………………………………………………………………………………..38

جدول2-4: شیب دمایی وتعیین دمای بهینه برای انجام واکنشو اندازه قطعات مورد نظر………… …………………………………………42

جدول 3-4: نتایج PCR انجام شده روی ایزوله ها ……………………………………………………………………………………………………42

جدول 4-4: فراوانی ESBL مثبت در انواع ایزوله  های حساس ونیمه حساس و مقاوم  به آنتی بیوتیک ها …………………………..43

جدول 5-4: فراوانی ESBL منفی در انواع ایزوله های حساس ونیمه حساس و مقاوم  به آنتی بیوتیک ها ……………………………44

فهرست شکل ها

شکل 1-3: تست آنتی بیوگرام به روش انتشار  در محیط مولر هینتون آگار.. ………………………………………………………………………27

شکل 1-4: نتایج تست فنوتیپی تاییدی فنوتیپی تاییدی…………………………………. ……………………………………………………………….39

شکل 2-4:   PCRژن های بتالاکتام  …………………………………………………………………………………………………………………………..41

شکل 3-4: نمودار درصد حضور ESBL درایزوله های مورد مطالعه  ………………………………………………………………………………….45

شکل 4-4: تعیین توالی وانطباق محصولPCR ژن  SHVبا توالی اصلی ……………………………………………………………………………..46

شکل 5-4: تعیین توالی وانطباق محصولPCR ژن  CTX_Mبا توالی اصلی ………………………………………………………………………..46

شکل 6-4: مقایسه ESBL درمطالعه حاضر و مطالعات انجام شده در نقاط مختلف   …………………………………………………………………49                                           شکل 7-4: مقایسه فراوانی ژن های مورد مطالعه با مطالعات انجام شده در نقاط مختلف   ……………………………………………………….