بررسی خواص ساختاری و سینتیکی آنزیم هاي لوسیفراز گونه ايرانيLampyris turkestanicus جهش یافته در اسید آمینه 300

   فهرست                                                                                         صفحه

    چکیده فارسی   

فصل مقدمه    

1- بيولومينسانس     …………………………………………………………………………………………………………………………..   2

1-1- بیولومينسانس درموجودات مختلف    ……………………………………………………………………………………..    2

1-1-1- بيولومينسانس در حشره­ي شب‌تاب (Firefly)  …………………………………………………………………   3

1-2- مكانيسم واكنش لوسيفراز و نشر نور   ……………………………………………………………………………………..    4

1-3- ترکیبات مرتبط با واکنش لوسیفراز   …………………………………………………………………………………………  6

1 -4-  مکانیسم هاي نشر نور در فرایند بیولومینسانس  …………………………………………………..   7

1-5-  کاربردهای لوسیفراز       …………………………………………………………………………………………….  8

1-6-  پايدارسازي آنزیم لوسیفراز         ………………………………………………………………………………… 11

1-6-1- ویژگی­های پروتئین­های ترموفیل    ………………………………………………………………………………………. 12

1 – 6-2- نقش آمينواسيدها در افزايش پايداري حرارتي پروتئين هاي ترموفيل   ………………………….    12

1-7- هدف از انجام پروژه حاضر     ………………………………………………………………………………………….           15

فصل مواد و روش ها   

2-1- مواد   ………………………………………………………………………………………………………………………………………      18

2-2- Quick-change PCR    ……………………………………………………………..       18

2-2-1- مشخصات و نقشه ناقل pET28a…………………………………………………….        18

2-2-2- انتخاب جهش‌ها   ……………………………………………………………………………………………………………………..  19

2-2-3- طراحي پرايمر  ………………………………………………………………………………………………………………………….. 20

2-3- الكتروفورز ژل آگارز   ……………………………………………………………………………………………………………………  23

2-4- هضم محصولات با Dpn1   ………………………………………………………………………………………………………..   24   

2-5- انتقال محصولات پاكسازي شده PCR به سلول هاي مستعد DH5α   ………………………………. 24

2-6- تهيه پلاسميد جهش يافته   …………………………………………………………………………………………………………  26

2-7- تعيين توالي cDNA   …………………………………………………………………………………………….  27

2-8- انتقال پلاسميد حاوي جهش به باكتري BL21  ………………………………………………………………………..  27

2-9- بيان پروتئين   ……………………………………………………………………………………………………………………………..  27

2-10-  تهيه محتواي سلولي از باكتري‌ها  ………………………………………………………………………………………….   28

2-11-تخليص پروتئين با ستون كروماتوگرافي   …………………………………………………………………………………  29

2-12- الكتروفورز SDS-PAGE   …………………………………………………………………………………….  30

2-13- سنجش غلظت پروتئين‌ها   ……………………………………………………………………………………………………..   30

2-14- محاسبه فعاليت ويژه ( Specific Activity) آنزيم   ……………………………………………………………   30

2-15- ثبت طيف نشري بيولومينسانس آنزيم لوسيفراز   ………………………………………………………………….   31

2-16- اندازه‌گيري فعاليت آنزيم عليه زمان(Decay rate)   ………………………………………………………….   31

2-17- بررسي دماي بهينه فعاليت آنزيم (optimum temperature)   …………………………….   31

2-17-2- اندازه‌گيري پايداری حرارتي و غير فعال شدن حرارتي آنزيم   …………………………………………..  32

2-18- بررسي pH بهينه فعاليت آنزيم   ……………………………………………………………………………………………..  32

2-19- مطالعه سينتيك فعاليت آنزيم    …………………………………………………………. 32

2-20- بررسي مطالعات ساختاري     …………………………………………………………………………………………….   33

2-20-1- دياليز نمونه‌ها   ……………………………………………………………………………………………………………     33

2-20-2- مطالعات دورنگ نمايي دوراني (CD)   …………………………………………………………..    33

2-20-3- مطالعات فلورسانس ذاتي (Intrinsic fluorescence   …………………………………..   34

2-20-4- مطالعات فلورسانس خارجي Extrinsic fluorescence))با ANS   ………………..     34

2-20-5- مطالعات خاموشي فلورسانس (Quenching)   ………………………………     35

2-21- مطالعات مدلینگ   …………………………………………………………………………………………………………      35

 

فصل نتايج  

3-1- انتخاب آمينو اسيدهاي مورد جهش   …………………………………………………………………………………….  37

3-2- پرايمرهاي مورد استفاده   ………………………………………………………………………………………………………   37

3-3- بدست آوردن پلاسميد حامل ژن آنزيم LRR   …………………………………………     38

3-4- جهش زايي هدفدار با روش QuickChange و بهينه سازي آن   ……………………………………..  38

3-5- تكثير محصول PCR در باكتري سويه DH5α    ………………………………………………………………   39

3-6- انتقال پلاسميد هاي حاوي جهش به سويه BL21 و بيان لوسيفرازهاي جهش يافته  ………   41

3-7- بررسي فعاليت وسينتيك آنزيم هاي wild-type و جهش يافته  ……………………………………..    41

3-8- تعيين دماي مطلوب فعاليت آنزيم هاي wild-type و جهش يافته  …………………………………    43

3-9- تعيينpH  مطلوب فعاليت آنزيم هاي wild-type و جهش يافته  ……………………………………..  44

3-10- غير فعال شدن حرارتي پروتئين ها (Remaining Activity)   …………………………………   46

3-11- بررسي پايداري حرارتي  (Thermal Stability)  …………………………………………………………   47

3-12- بررسي طيف نشري بيولومينسانس پروتئين‌هاي جهش يافته و wild-type   ……………….   47

3-13- مطالعات ساختاري آنزيم هاي wild-type و جهش يافته …………………………………………………  48

3-13-1- مطالعات ساختاري با استفاده از دورنگ‌نمايي دوراني (CD)   ……………………………..    48

3-13-2- بررسي طيف فلورسانس ذاتي (Intrinsic Fluorescence)   …………………….    49

3-13-3- بررسي طيف فلورسانس خارجي((Extrinsic Fluorescence   ……………………  51

3-13-4- بررسي خاموش شدن(Quenching)   فلورسانس بوسيله آكريل آميد و يديد پتاسيم ….52

3-13-5- مطالعات مدلينگ   …………………………………………………………………………………………………………..  53

فصل بحث  

4-1- آنزیم لوسیفراز          ……………………………………………………………………………………………………………..   56

4-2- جهش زايي و ساخت پروتئين هاي نوتركيب جديد    …………………………………………………………..   58

4-3- تاثير جهش ها بر K_m لوسيفرين و ATP لوسيفرازهاي طبيعي و جهش يافته   …………………  58

4-4- بررسي طيف بيولومينسانس آنزيم ها    …………………………………………………………………………………  58

4-5- غير فعال شدن حرارتي پروتئين ها (Remaining Activity)   …………………………………….   59

4-6- پايداري حرارتي و درجه حرارت مطلوب آنزيم ها   ……………………………………………………………….   59

4-7- بررسي تغييرات طيف هاي  CD   ………………………………………………………..   60

4-8- تغييرات طيف فلورسانس ذاتي آنزيم ها   ……………………………………………………………………………..   61

4-9- تغييرات طيف فلورسانس خارجي آنزيم ها    ……………………………………………………………………      62

4-10- بررسي نتايج Quenching  آنزيم ها توسط KI و Acrylamide   ……………………  63

4-11- بررسي مطالعات مدلينگ آنزيم ها   ……………………………………………………………………………………..  63

نتيجه گيري   ……………………………………………………………………………………………………..  65

منابع   ………………………………………………………………………………………………………………..  66

چکیده  انگلیسی   .………………………………………………………………………………………………………………….   74