%53تخفیف

بررسی تکثیر، تهاجم و آپوپتوز در جمعیت هایCD133+ و CD133- رده سلولی Jurkat در محیط کشت اسیدی

لوسمی لنفوبلاستی سلول T حاد (T-ALL) یک بیماری خونی بدخیم پیش ساز های سلول  T است. مشخص شده است که برخی از بیماران T-ALL مقاوم به درمان هستند. علت عمده شکست درمان در سرطان ها را می توان به وجود سلول های بنیادی سرطانی مرتبط دانست. شناسایی این گروه از سلول ها به ما برای شناسایی مکانیسم های مقاومت کمک می کند و این کار وابسته به مارکرهای خاص برای شناسایی سلول های بنیادی سرطانی است. CD133 یکی از مهمترین مارکرهایی است که برای شناسایی سلول های بنیادی سرطانی به کار می رود. از سوی دیگر مطالعات زیادی نشان داده اند که pH اسیدی خارج سلولی نقش مهمی در مقاومت به شیمی درمانی، تکثیر و خصوصیات متاستازی برعهده دارد. هدف از این مطالعه بررسی تاثیر محیط اسیدی  بر جمعیت های سلولی CD133+ و CD133 دارد برای این کار تکثیر، تهاجم و آپوپتوز سلول ها در شرایط اسیدی بررسی  شد. سلول های Jurkat در محیط اسیدی با 6/6 pH: به مدت 3 هفته کشت داده شدند. سپس جمعیت های سلولی CD133+ و CD133 با استفاده از سیستم MACS جدا شده و بلافاصله تکثیر، تهاجم و آپوپتوز القا شده توسط داروی دوکسوروبیسین اندازه گیری شدند. نتایج نشان داد که تکثیر، تهاجم و آپوپتوز سلول های کشت داده شده در محیط اسیدی به طور قابل توجهی بالاتر از سلول های کشت داده شده در محیط نرمال بودند. همچنین سلول های CD133+ مهاجم تر که نتیجه بررسی های بیان ژنی و … بود. و مقاوم تر به شیمی درمانی نسبت به سلول های CD133 بودند. با توجه به نتایج به دست آمده سلول های CD133+ رده سلولی Jurkat ویژگی  های سلول های بنیادی سرطانی را ار خود نشان دادند و می توانند به عنوان مارکر سلول بنیای سرطانی در این رده سلولی پیشنهاد شوند. همچنین تغییر در مسیرهای متابولیسمی که در سلول های بنیادی سرطانی دیده می شود و منجر به اسیدی شدن محیط توموری شده به حفظ جمعیت های سلول های بنیادی سرطانی و کسب و حفظ ویژگی های این سلول ها کمک می کند.

کلمات کلیدی: CD133، محیط اسیدی، تکثیر، تهاجم، آپوپتوز، رده سلولی Jurkat

فهرست مطالب

فصل اول: مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته 1

1-1. مقدمه 2

1-2. سرطان خون 3

1-2-1. لوسمی حاد 3

1-2-2. لوسمی مزمن 4

1-2-3. لوسمی میلوئیدی 4

1-2-4. لوسمی لنفوئیدی 4

1-3. لوسمی حاد لنفوبلاستی 4

1-3-1. نشانه ها و علائم لوسمی حاد لنفوبلاستی 5

1-3-2. طبقه بندی لوسمی حاد لنفوبلاستی 7

1-4. روش های درمان ALL 9

1-4-1. شیمی درمانی در ALL 10

1-5. طبیعت چند مرحله ای تکامل سرطان 12

1-5-1. متاستاز……………………………………………………………………………………………………………………………………..13

1-5-2. ماتریکس متالوپروتئینازها 16

1-5-3. انتشار رگی و لانه گزینی سلول های تومور 17

1-6. سلول های بنیادی و سرطان 19

1-6-1. مارکرهای سلول های بنیادی سرطانی 20

1-7. مقاومت به شیمی درمانی 21

1-7-1. مکانیسم های مقاومت دارویی سلول های بنیادی سرطانی 22

1-8. گلیکولیز هوازی 28

1-8-1. فواید گلیکولیز هوازی برای سلول های سرطانی 32

1-9. تعادل اسید-باز 33

1-10. اهداف 34

1-11. فرضيه ها/ پيش فرض ها 34

فصل دوم: مواد و روش ها 35

2-1. تجهیزات مورد استفاده 36

2-2. مواد مصرفی 37

2-3. بافرها، محیط های کشت و محلول ها 39

2-3-1. PBS 1X……………………………………………………………………………………………………………………………………39

2-3-2. بافر تریس-EDTA (TE) 39

2-3-3. بافرTAE 50 X 40

2-4. محیط های مورد استفاده 41

2-4-1. محیط RPMI-1640 41

2-4-2. مکمل هاي محيط کشت 42

2-5. کیت ها 43

2-6. کشت سلول 43

2-6-1. كشت مجدد 44

2-6-2. شرايط کشت سلول 44

2-6-3. فريز كردن سلول ها 45

2-6-4. دفريز سلول ها 46

2-6-5. شمارش سلولي به وسيله لام نئوبار 47

2-7. نشاندار سازی سلول ها با CD133 – Microbeads 47

2-8. جداسازی سلول های CD133+ از سلول های CD133با MACS 48

2-9. فلوسايتومتری 50

2-9-1. بررسی و تائید درصد خلوص سلول های جدا شده براساس ماركر CD133 50

2-10. بررسی تکثیر سلول ها از طریق روش شمارش مستقیم 50

2-11. بررسی تهاجم سلولی (invasion assay) 50

2-11-1. مراحل کار تست invasion assay 51

2-12. بررسی آپوپتوز سلول ها بعد از القا دارو شیمی درمانی doxorubicin با روش Annexin V  و Propidium Iodide 51

2-12-1. محاسبه دوز دارو شیمی درمانی Doxorubicin 52

2-12-2. مراحل کار تست Annexin V-PI 52

2-13. استخراج RNA  ( RNA extraction ) 53

2-13-1. مراحل کار استخراج  RNA با RNXTM(plus) 54

2-13-2. کنترل کیفی RNA استخراج شده 55

2-14. واکنش رونویسی معکوس 56

2-14-1. سنتز cDNA mRNA با کیت CinnaGen 56

2-15. تست RT-PCR 58

2-16. الکتروفورز ژل 59

2-17. Realtime-PCR 60

2-17-1. انجام Real Time PCR ژن های ABC-G2،  MMP9با استفاده از کیت Ampiliqon 61

2-18. آنالیز آماری 63

2-19. نرم افزار های مورد استفاده 63

فصل سوم: نتایج و یافته ها 64

3-1. جداسازی سلول های CD133+ و CD133 رده سلولی Jurkat 65

3-2. بررسی و مقایسه تکثیر سلول های CD133+ و CD133 رده سلولی Jurkat 66

3-3. بررسی و مقایسه میزان تهاجم سلول های CD133+ و CD133 رده سلولی Jurkat 72

3-3-1. نتایج حاصل از تست invasion assay 72

3-3-2. نتایج حاصل از ارزیابی های مولکولی 74

3-4. بررسی و مقایسه میزان آپوپتوز سلول های CD133+ و CD133 رده سلولی Jurkat 77

3-4-1. نتایج حاصل از تست Annexin V-PI 78

3-4-2. نتایج حاصل از Real time-PCR ژن ABCG2 80

فصل چهارم: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات 84

4-1. بحث 85

4-2. نتیجه گیری 94

4-3. پیشنهادات 94

فهرست منابع 96

چکیده انگلیسی 103

فهرست جداول

جدول ‏1‑1. مارکر سطح سلولی سلول های بنیادی سرطانی 28

جدول ‏1‑2. ناقلین ABC که در مقاومت دارویی نقش دارند. 31

جدول ‏1‑3. پروتئین های خانواده Bcl-2 35

جدول ‏2‑1. مقادیر مواد لازم برای تهیه  PBS 1X 47

جدول ‏2‑2. مقادیر مواد لازم برای تهیه TE 47

جدول ‏2‑3. مقادیر مواد لازم برای تهیه TAE 50X 48

جدول ‏2‑4. رنگ های فنل رد در pH های مختلف 53

جدول ‏2‑5. مقادير مورد استفاده جهت مرحله اول cDNA سازی. 64

جدول ‏2‑6. مقادير مورد استفاده جهت  مرحله دوم  cDNAسازی. 65

جدول ‏2‑7. چرخه دمايی cDNA سازی. 66

جدول ‏2‑8. مواد و مقادیر مورد استفاده واکنش PCR 67

جدول ‏2‑9. برنامه دمایی واکنش PCR 67

جدول ‏2‑10. مواد و مقادیر لازم جهت واکنش Real Time PCR mRNA 70

جدول ‏2‑11. توالی پرایمر های مورد استفاده برای ژن های ABC-G2، MMP9، GAPDH و β-Actin (کنترل داخلی). 70

جدول ‏2‑12. برنامه دمایی Real Time PCR mRNA 71

جدول ‏3‑1.Ct میانگین ژن های مورد بررسی. 82

جدول ‏3‑2. Ct میانگین ژن های مورد بررسی. 86

 

 

 

 

فهرست نمودارها

نمودار ‏3‑1. درصد خلوص سلول های+Jurkat  CD133 جدا شده از محیط اسیدی 75

نمودار ‏3‑2. درصد خلوص سلول های  CD133+ Jurkat جداشده از محیط نرمال 76

نمودار ‏3‑3. میزان تکثیر سلول های  +CD133 و CD133 رده سلولی Jurkat در محیط اسیدی 77

نمودار‏3‑4. میزان تکثیر سلول های +CD133 و CD133 رده سلولی Jurkat در محیط نرمال 77

نمودار‏3‑5. مقایسه تکثیر سلول های Jurkat + CD133 و CD133 در محیط اسیدی در هر روز 78

نمودار ‏3‑6. مقایسه تکثیر سلول های Jurkat +CD133 و CD133 در محیط نرمال در هر روز 79

نمودار ‏3‑7. درصد سلول های+CD133 بعد از گذشت 24 ساعت از زمان جداسازی در محیط اسیدی 79

نمودار ‏3‑8. درصد سلول های +CD133 بعد از گذشت 24 ساعت از زمان جداسازی در محیط نرمال 80

نمودار‏3‑9. مقایسه تکثیر سلول های CD133+ Jurkat در محیط اسیدی و نرمال (A CD133+: سلول های CD133+ Jurkat کشت داده شده در محیط اسیدی؛ N CD133+: سلول های CD133+ Jurkat کشت داده شده در محیط نرمال). 81

نمودار ‏3‑10. مقایسه تکثیر سلول های CD133 Jurkat در محیط اسیدی و نرمال. (A CD133: سلول های CD133 Jurkat کشت داده شده در محیط اسیدی؛ N CD133: سلول های CD133 Jurkat کشت داده شده در محیط نرمال). 81

نمودار‏3‑11. نتایج به دست آمده از تست invasion assay، مقایسه میزان تهاجم سلول هایJurkat  CD133+ با سلول های CD133 محیط اسیدی (سمت راست) و محیط نرمال (سمت چپ). 83

نمودار‏3‑12.نتایج به دست آمده از تست invasion assay، مقایسه میزان تهاجم سلول هایJurkat  CD133+ محیط اسیدی با سلول هایCD133+ محیط نرمال (سمت چپ) و سلول هایJurkat  CD133 محیط اسیدی با سلول های CD133 محیط نرمال (سمت راست). 83

نمودار ‏3‑13. نمودارAmplification ژن MMP9 85

نمودار ‏3‑14.منحنی ذوب(Melt curve) ژن MMP9. 86

نمودار ‏3‑15.نتایج حاصل از Realtime-PCR ژن MMP9. مقایسه میان سلول هایJurkat  +CD133 وCD133 محیط اسیدی با یکدیگر(سمت راست) و مقایسه میان سلول هایJurkat +CD133 وCD133 محیط نرمال با یکدیگر (سمت چپ). 86

نمودار ‏3‑16. نتایج حاصل از Realtime-PCR ژن MMP9. مقایسه میان سلول هایJurkat  +CD133 اسیدی با سلول های+ CD133نرمال (سمت چپ) و مقایسه میان سلول های Jurkat CD133 محیط اسیدی با سلول های CD133 محیط نرمال (سمت راست). 87

نمودار ‏3‑17. نتایج حاصل از Annexin-PI. نمودار سمت چپ سلول های  Jurkat + CD133و نمودار سمت راست سلول های CD133 Jurkat در محیط نرمال. 88

نمودار ‏3‑18. نتایج حاصل از Annexin-PI. مقایسه میزان آپوپتوز سلول های Jurkat + CD133محیط اسیدی و نرمال با یکدیگر (سمت چپ) و مقایسه میزان آپوپتوز سلول های CD133 Jurkat در محیط اسیدی و نرمال با یکدیگر (سمت راست). 88

نمودار ‏3‑19. نتایج حاصل از Annexin-PI .نمودار سمت چپ سلول های CD133+Jurkat و نمودار سمت راست سلول های CD133 Jurkat در محیط اسیدی. 89

نمودار ‏3‑20. نتایج حاصل از Annexin-PI. مقایسه میزان آپوپتوز سلول های Jurkat + CD133و CD133 محیط اسیدی با یکدیگر (سمت چپ) و مقایسه میزان آپوپتوز سلول های Jurkat + CD133و CD133 محیط نرمال با یکدیگر (سمت راست). 90

نمودار ‏3‑21.نمودار Amplification ژن ABCG2 91

نمودار ‏3‑22. منحنی ذوب(curve (Melt ژن ABCG2. 91

نمودار ‏3‑23. نتایج حاصل از Realtime-PCR ژن .ABCG2 مقایسه میان سلول هایJurkat + CD133 و CD133  محیط اسیدی با یکدیگر (سمت راست) و مقایسه میان سلول های Jurkat + CD133 و CD133 محیط نرمال با یکدیگر (سمت چپ). 92

نمودار ‏3‑24. نتایج حاصل از Real time-PCR ژن .ABCG2 مقایسه میان سلول های Jurkat +CD133 اسیدی با سلول های +CD133 نرمال (سمت چپ) و مقایسه میان سلول های Jurkat CD133 محیط اسیدی با سلول های CD133 محیط نرمال (سمت راست). 93

فهرست شکل ها

شکل ‏1‑1. مهار فسفوریلاسیون اکسیداتیو به وسیله قلیایی شدن داخل سلولی. 30

شکل ‏2‑1. مراحل جداسازی سلول های CD133+ با روش MACS 49

شکل ‏2‑2 گروه های مورد مطالعه در این طرح 49

شکل ‏3-1. نتیجه PCR – RT ژن بتا اکتین همراه با مارکر DNA 50 bp. ntc : کنترل منفی، N: محیط نرمال. 75

قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
Loading...
enemad-logo