بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR

فهرست مطالب

عنوان

صفحه

چکیده ……………………………………………………………………………………………………………………

1

فصل اول: مقدمه و کلیات …………………………………………………………………………………………

2

1-1- مقدمه…………………………………………………………………………………………………………….

3

1-1-2- گیاهان دارویی…………………………………………………………………………………………….

4

1-1-3- گیاهانی که به عنوان گیاه دارویی شناخته می شوند  ……………………………………….

4

1-1-4- دلایل رویکرد به گیاهان دارویی…………………………………………………………………….

5

1-1-5- مواد مؤثره گیاهان دارویی……………………………………………………………………………..

1-1-5-1- متابولیت های ثانویه…………………………………………………………………………………

6

7

1-1-5-2- طبقه بندی متابولیت های ثانویه…………………………………………………………………

8

1-1-5-3- تولید متابولیت های ثانویه از گیاهان دارویی………………………………………………..

10

1-1-5-4- راهکارهای افزایش متابولیت های ثانویه گیاهی از طریق کشت بافت …………….

10

1-1-6- بیوتکنولوژی و کشت بافت گیاهان دارویی …………………………………………………….

11

1-1-7- هدف از اصلاح گیاهان دارویی……………………………………………………………………..

12

1-2- بارهنگ………………………………………………………………………………………………………….

14

1-2-1- رده بندی علمی بارهنگ………………………………………………………………………………

14

1-2-2- تاریخچه بارهنگ…………………………………………………………………………………………

15

1-2-3- خصوصیات گیاه شناسی بارهنگ……………………………………………………………………

15

1-2-3-1- اختصاصات ظاهری گونه ………………………………………………………………………..

15

1-2-4- چند گونه از خانواده های بارهنگ………………………………………………………………….

16

1-2-5- محل رویش و پراکندگی طبیعی بارهنگ…………………………………………………………

17

1-2-6- نیازهای اکولوژیکی بارهنگ………………………………………………………………………….

17

1-2-7- ترکیبات بارهنگ………………………………………………………………………………………….

18

1-2-8- خواص درمانی بارهنگ ……………………………………………………………………………….

19

1-3- کاربردهای م هم کشت بافت در اصلاح نباتات……………………………………………………

19

1-4- تنوع سوماکلونال …………………………………………………………………………………………….

20

1-4-1- تنوع سوماکلونال در کشت بافت گیاهی………………………………………………………….

20

1-4-2- منشاء و چگونگی ایجاد تنوع سوماکلونال……………………………………………………….

21

1-4-2-1- تغییرات ژنتیکی(وراثت پذیر)……………………………………………………………………

21

1-4-2-1-1- تغییر در سطح پلوئیدی…………………………………………………………………………

21

1-4-2-1-2- تغییرات ساختمانی در DNA هسته‌ای…………………………………………………..

23

1-4-2-1-3- نوترتیبی شیمری………………………………………………………………………………….

23

1-4-2-2- تغییرات اپیژنتیکی(وراثت ناپذیر)……………………………………………………………….

24

1-4-3- کنترل تنوع سوماکلونال………………………………………………………………………………..

24

1-4-4- کاربرد تنوع سوماکلونال در اصلاح نباتات………………………………………………………

26

1-5- مارکر(نشانگر)…………………………………………………………………………………………………

26

1-5-1- انواع نشانگرهای ژنتیکی………………………………………………………………………………

27

1-5-1-1- نشانگرهای مورفولوژیک………………………………………………………………………….

27

1-5-1-2- نشانگرهای مولکولی………………………………………………………………………………..

27

1-5-1-2-1- نشانگرهای پروتئینی…………………………………………………………………………….

28

1-5-1-2-2- مارکرهای DNA………………………………………………………………………………..

28

1-5-1-2-2-1- مارکرهای DNA غیرمبتنی برPCR…………………………………………………

29

1-5-1-2-2-2- مارکرهای DNA مبتنی برPCR………………………………………………………

30

1-6- دلایل استفاده از نشانگرهای مولکولی در زمینه گیاهان دارویی……………………………….

32

1-7- اهداف مشخص تحقیق…………………………………………………………………………………….

33

فصل دوم: بررسی منابع……………………………………………………………………………………………..

34

2-1- بررسی مرور منابع……………………………………………………………………………………………

35

فصل سوم: مواد و روش‌ها…………………………………………………………………………………………

45

3-1- آزمایش اول…………………………………………………………………………………………………….

46

3-1-1- مواد گياهي…………………………………………………………………………………………………

46

3-1-2- محیط کشت……………………………………………………………………………………………….

46

3-1-3- دستورالعمل تهیه یک لیتر محیط کشت MSFull……………………………………………

49

3-1-4-استریل کردن بذور………………………………………………………………………………………..

50

3-1-5- محیط کشت جوانه زنی………………………………………………………………………………..

50

3-1-6- مرحله کالزایی……………………………………………………………………………………………..

50

3-2- آزمایش دوم……………………………………………………………………………………………………

51

3-2-1- بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR…………………..

51

3-2-2- مواد گیاهی…………………………………………………………………………………………………

51

3-2-3- استخراج DNA ژنومی……………………………………………………………………………….

53

3-2-4- تهیه بافرTE……………………………………………………………………………………………….

54

3-2-5- تهیه بافر(5x) TBE)…………………………………………………………………………………..

54

3-2-5-1- تهیه بافر(1x) TBE)………………………………………………………………………………

54

3-2-6- تعیین کیفیت و کمیت DNA ژنومی استخراج شده…………………………………………

55

3-2-7- انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز(PCR)…………………………………………………………

55

3-2-8- چرخه حرارتی در دستگاهPCR……………………………………………………………………

56

3-2-9- الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگارز…………………………………………………

57

3-2-10- توالی آغازگرهای مورد استفاده……………………………………………………………………

58

3-2-11-تجزیه و تحلیل داده‌ها…………………………………………………………………………………

59

3-2-11-1-امتیازدهی باندها……………………………………………………………………………………..

59

3-2-11-2- تجزیه خوشه‌ای…………………………………………………………………………………….

59

3-2-11-3- شاخص‌های مولکولی…………………………………………………………………………….

61

فصل چهارم نتایج و بحث………………………………………………………………………………………….

62

4-1- نتایج مربوط به بررسی الگوی باندی DNA……………………………………………………….

63

4-2- بررسی محتوای اطلاعات چند شکل (PIC)……………………………………………………….

64

4-3- درجه تشابه ژنتیکی………………………………………………………………………………………….

69

4-4- توزیع فراوانی فاصله ژنتیکی……………………………………………………………………………..

71

4-5- تجزیه خوشه‌ای……………………………………………………………………………………………….

71

4-6- نتایج حاصله از تجزیه به مختصات اصلی(PCO)……………………………………………….

75

4-7- نتیجه‌گیری……………………………………………………………………………………………………..

77

4-8- پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………

79

منابع………………………………………………………………………………………………………………………..

80

چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………..

II

فهرست اشکال

عنوان

صفحه

شکل 4-1: کالوس ریزنمونه برگ (سمت راست) و ریزنمونه ریشه (سمت چپ)……………..

63

شکل4-2:الگوی باندی 19 تیمار بارهنگ با استفاده از آغازگرهای IS16 (شکل بالا)وIS11 (شکل پایین)………………………………………………………………………………………….

67

نمودار 4-3: توزیع فراوانی مقادیر فاصله ژنتیکی بین تیمارهای مورد مطالعه…………………….

71

شکل 4-4: دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای با استفاده از ضریب تشابه دایس……………

74

شکل 4-5: ترسیم بای پلات 19 تیمار مورد بررسی بر اساس دو محور مختصات اصلی اول و دوم………………………………………………………………………………………………………………………

76

فهرست جداول

عنوان

صفحه

جدول 3-1: ترکیبات معدنی محیط پایه MS کامل……………………………………………………….

46

جدول 3-2: دستور العمل تهیه یک لیتر محیط پایه MS………………………………………………..

47

جدول 3-3:اجزاء سازنده استوک عناصر ماکرو……………………………………………………………..

47

جدول 3-4:اجزاء سازنده استوک عناصر میکرو…………………………………………………………….

48

جدول 3-5:اجزاء سازنده استوک عناصر میکروII………………………………………………………….

48

جدول 3-6: اجزای سازنده استوک آهن………………………………………………………………………

48

جدول 3-7: اجزاء سازنده استوک ویتامین……………………………………………………………………

49

جدول 3-8: ترکیبات هورمونی مورد استفاده در کالزایی…………………………………………………

51

جدول 3-9: ریزنمونه های مورد استفاده در فاز کالزایی…………………………………………………

51

جدول 3-10: مواد گیاهی مورد استفاده………………………………………………………………………..

52

جدول 3-11: اجزاء بافر TE……………………………………………………………………………………..

54

جدول 3-12: اجزاء بافر (5x) TBE)………………………………………………………………………..

54

جدول3-13: اجزای مورد استفاده برای تهیه 20 میکرولیتر Mastermix………………………..

55

جدول 3-14: چرخه حرارتی PCR……………………………………………………………………………

56

جدول 3-15: توالی آغازگرهای مورد استفاده……………………………………………………………….

58

جدول 3-16 : وضعیت دو فرد j , i با همدیگر از نظر یک صفت نشانگری…………………….

59

جدول 4-17 : نتایج بررسی 19 تیمار گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از نشانگر ISSR……..

66

جدول 4-18: مواد گیاهی مورد استفاده………………………………………………………………………..

68

جدول 4-19: ماتریس تشابه بر اساس نشانگر ISSR و ضریب تشابه دایس…………………….

70

جدول 4-20: گروه بندی تیمارها بر اساس تجزیه خوشهای…………………………………………..

73