بررسی تغیر بیان ژن هایLTP (پروتئین انتقال دهنده چربی) و SOS1 (آنتی پورتر ( Na+/H+ در پاسخ به تنش شوری در ارقام مختلف گندم نان وخویشاوند وحشی آن

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                           صفحه

فصل اول: مقدمه و اهداف…………………………………………………………………………………………………………………………………. 1

1-1-مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-1-1 – تنش شوری……………………………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-1-2- اهمیت غلات………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-1-3- گیاه شناسی گندم……………………………………………………………………………………………………………………….. 4

1-1-4-گندم امر………………………………………………………………………………………………………………………………………… 5

1-1-5- معرفی ژن SOS1………………………………………………………………………………………………………………………… 5

1-1-6- معرفی ژنLTP…………………………………………………………………………………………………………………………….. 6

1-2- راهکارهای مقابله با شوری در عصر حاضر………………………………………………………………………………………………….. 7

1-3- اهداف پژوهش……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 7

فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین ……………………………………………………………………………………………………. 8

2-1- خاک های شور…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 9

2-2- چگونه شوری برای گیاه مشکل ایجاد می کند………………………………………………………………………………………… 10

2-3- مکانیسم های مقابله با تنش شوری در گیاهان………………………………………………………………………………………… 10

2-4- مکانیسم های مولکولی تحمل به تنش شوری…………………………………………………………………………………………. 11

2-5- انواع گیاهان بر اساس واکنش رشد به شوری………………………………………………………………………………………….. 11

2-6- ژنهای درگیر در تحمل به تنش شوری……………………………………………………………………………………………………… 13

2-7- مسیر ژنهای SOS در تحمل به تنش شوری……………………………………………………………………………………………. 14

2-8- شناسایی و نامگذاری ژن LTP………………………………………………………………………………………………………………….. 14

2-9- گروه بندی LTP ها…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 16

2-10- معرفي واکنش Real-time PCR……………………………………………………………………………………………………………. 17

2-11- معرفي روش کمي سنجي مطلق (Absolute Quantification) براي کمي کردن بيان ژن درReal-time  PCR …………. 19

2-12- معرفي روش کمي سنجي نسبي Relative Quantification))  براي کمي کردن بيان ژن در Real-time PCR………….. 20

2-13- تعيين راندمان Real-time PCR……………………………………………………………………………………………………………. 20

2-14- کمي کردن نسبي بيان ژن در Real-time PCR با فرض راندمان 100 درصد…………………………………… 23

2-15- کمي کردن نسبي بيان ژن با Real-time PCR در صورت متغير بودن راندمان يا کمتر از 100 درصد 24

2-16- تاثیر تنش­شوری بر ویژگی­های بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………….. 24

فصل سوم: مواد و روش تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………….. 27

3-1- انتخاب ژنوتيپ گندم ………………………………………………………………………………………………………………………………. 28

3-2-تأیید مقاومت رقم  ارگ و حساسیت رقم الموت به تنش شوری …………………………………………………………. 28

3-3-کاشت بذر ها ……………………………………………………………………………………………………………………………………………… 28

3-4- انتخاب نوع محيط کشت مايع …………………………………………………………………………………………………………………. 30

3-5- شرايط کنترل شده محيط گلخانه …………………………………………………………………………………………………………… 32

3-6- اعمال تنش شوری با نمک (150 میلی مولار) ……………………………………………………………………………………….. 32

3-7- نمونه‌گيري از بافت برگي و ریشه …………………………………………………………………………………………………………….. 33

3-8- استخراجRNA  از بافت برگ و ریشه ……………………………………………………………………………………………………… 33

3-9-  تيمار DNAse براي حذف آلودگي ژنومي در RNA استخراج شده ………………………………………………….. 35

3-10- سنتز رشته اول cDNA از RNA  ……………………………………………………………………………………………………….. 36

3-11- طراحي آغازگرهاي اختصاصي به منظور بررسي بيان ژنهای LTP و SOS1 …………………………………….. 38

3-12- تکثير ‌‌ cDNAهای سنتز شده با استفاده از آغازگرهای LTP ، 18S rRNA  و  SOS1بوسیله واکنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 40

3-13- واكنش Real time RT-PCR (Relative) براي cDNA هاي تهيه شده …………………………………………… 42

3-14- واكنش  Real time RT-PCR ژن LTP وSOS1 و ژن‌های كنترل داخلي  18S rRNA ………………… 42

3-15- روش نرمال‌سازي بيان ژنهای  LTPوSOS1 پس از واكنش Real-time PCR  ………………………………… 44

3-16- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم پر اکسیداز (POD) …………………………………………………………………………. 44

3-17- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) …………………………………………………………………………………. 45

3-18- آنالیز پروموتر ژن های LTP و SOS1……………………………………………………………………………………………………. 45

فصل چهارم: نتایج و بحث………………………………………………………………………………………………………………………………… 46

4-1- نتایج …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 47

4-1-1- استخراج RNA ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 47

4-1-2- تعیین کمیت و کیفیت RNA استخراج شده …………………………………………………………………………… 47

4-1-3- كمي كردن ميزان بيان ژن LTP در شرايط تنش شوری با استفاده از RT-PCR Real time 48

4-1-4- كمي كردن ميزان بيان ژن SOS1 در شرايط تنش شوری با استفاده از RT-PCR   Real time 53

4-1-5- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم پر اکسیداز (POD) ………………………………………………………………. 58

4-1-6- اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT) ………………………………………………………………………… 62

4-1-7- نتایج آناليز پروموتر ژن‌ SOS1  و LTP در گیاه برنج………………………………………………………………… 65

4-2- بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 68

4-2-1- بررسی سطح بیان ژن SOS1 و نقش آن در سلول ………………………………………………………………….. 70

4-2-2-  بررسی سطح بیان ژن LTP و نقش آن در سلول ……………………………………………………………………. 71

4-2-3-  تاثیر تنش­شوری بر ویژگی­های بیوشیمیایی …………………………………………………………………………….. 73

4-2-4- نتیجه گیری کلی …………………………………………………………………………………………………………………………. 74

4-3- پیشنهاد ها  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 75

فصل پنجم: منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 77

 

 

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                                        صفحه

جدول  3-1- ترکیبات غذایی محيط کشت مايع هوگلند……………………………………………………………………………… 31

 جدول 3-2- مواد مورد نياز براي تيمار DNAse شرکت فرمنتاز………………………………………………………………… 35

 جدول 3-3  – نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز cDNA …………………………………………………………………. 36

جدول 4-3 – نوع و مقدار مواد مورد استفاده در سنتز رشته اول cDNA در مرحله دوم………………………….. 37

جدول 3-5- اسامي و توالي آغازگرهاي طراحي شده با نرم افزار  Alell ID 6و10  Vector NTI به منظور بررسي بيان ژن LTP و SOS1 همچنین دمای اتصال و طول قطعه تکثیر شده…………………………………………………………………….. 39

جدول 3-6- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واکنش زنجيره اي پليمراز…………………………………………………. 40

جدول 3-7- چرخه حرارتي واکنش زنجيره‌اي پليمراز و دماي اتصال با توجه به نوع پرايمر مورد استفاده تعيين شد که در جدول زیر آمده است…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 41

جدول 3-8 – سيكل گرمايي استفاده شده در واكنش Real-time PCR ژن اصلي LTP  وSOS1 و كنترل داخلي 18srRNA…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

جدول 3-9 – نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واكنش  Real-time PCRبراي ژنهای اصلي LTP وSOS1 و ژن كنترلي داخلي 18srRNA  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 43

جدول4 -1- میزان آنزیم پر اکسیداز در ریشه و برگ ارقام آجیلوپس، ارگ و الموت تحت تنش شوری
150 mM…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 58

جدول 4 -2 – میزان خطای محاسبه شده در ریشه و برگ ارقام آجیلوپس،ارگ و الموت تحت تنش شوری
150 mM…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 58

جدول 4 -3 – میزان آنزیم کاتالاز در ریشه و برگ ارقام آجیلوپس، ارگ و الموت تحت تنش شوری
150 mM…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 62

جدول4 -4  – میزان خطای محاسبه شده در ریشه و برگ ارقام آجیلوپس،ارگ و الموت تحت تنش شوری
150 mM…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 62

جدول 4 -5- مهمترین موتیف های عمومی و اختصاصی احتمالی موجود در پروموتر ژن  SOS1 در گیاه برنج که از سایت هایPhytozome  وPlantcare   استفاده شد……………………………………………………………………………………………………. 66

جدول4 -6 – مهمترین موتیف های عمومی و اختصاصی موجود در پروموتر ژن LTP در گیاه برنج…………. 66

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                                     صفحه

شکل 2-1- ساختار خانواده 1 و 2 پروتئین LTP……………………………………………………………………………………………… 16

شکل2-2- تعيين Ct با استفاده از نمودارتکثير…………………………………………………………………………………………………. 18

شکل2-3- رسم منحني استاندارد در روش کمي سنجي مطلق بيان ژن در Real-time PCR……………………. 19

شکل2-4- تعيين راندمان دو آغازگر ژن هدف و کنترل داخلي………………………………………………………………………. 21

شکل2-5- معادله محاسبه راندمان Real-time PCR بر اساس نمودار تکثير…………………………………………………. 21

شکل 2-6- نمودار نيمه‌لگاريتمي تکثير Real-time PCR که معادله خط راست روي آن نوشته شده است. 22

شکل 2-7- نمودار نیمه‌لگاريتمي تکثير Real-time PCR که معادله شيب خط روي آن نوشته شده است. 22

شکل3-1- کشت بذرها بر روي کاغذ صافي مرطوب در اتاقک رشد………………………………………………………………… 28

شکل 3-2- مخلوط کوکوپیت – پرلایت مرطوب و کاشت بذرهای هر دو ژنوتیپ در سيني‌هاي کشت هر چهار تشتک   29

شکل 3-3- تشتک‌های حاوی محیط کشت هوگلند و بذور گندم کاشته ‌شده در آن‌ها………………………………… 30

شکل3-4- هوادهي ريشه ها توسط پمپ آکواريومي در محيط هوگلند…………………………………………………………… 31

شکل 3-5- گياهچه‌هاي گندم، 13 روز بعد از تنش شوری 150 mM……………………………………………………………. 32

شکل 3-6- استخراج Total RNA قبل از تیمار DNase I………………………………………………………………………………. 35

شکل 3-7- استخراج Total RNA بعد از تيمار DNAase………………………………………………………………………………. 36

شکل3-8- تصوير ژل الکتروفورز cDNA……………………………………………………………………………………………………………. 38

شکل3-9- باند 199 جفت‌بازي که با پرایمر LTP…………………………………………………………………………………………….. 41

شکل 3-10- دستگاه اسپکتروفوتومتر………………………………………………………………………………………………………………… 46

شکل 4-1- الکترو فورز RNA استخراج شده از برگ گندم آجیلوپس , الموت و ارگ (چپ به راست) بر روی ژل 1% آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 47

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                      صفحه

نمودار 4 -1-  میزان بیان ژنLTP  دربرگ ژنوتیپ های الموت، ارگ و آجیلوپس………………………………………. 48

نمودار 4-2- میزان بیان ژنLTP  درریشه ژنوتیپ های الموت، ارگ و آجیلوپس………………………………………… 49

نمودار 4-3- میزان بیان ژن  LTP در برگ و ریشه الموت ……………………………………………………………………………. 50

نمودار 4-4- میزان بیان ژن  LTP در برگ و ریشه ارگ در زمان های 6،3 و24 ساعت پس از اعمال تنش شوری 150 میلی مولار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 51

نمودار 4-5- میزان بیان ژن  LTP در برگ و ریشه آجیلوپس در زمان های 6،3 و24 ساعت پس از اعمال تنش شوری 150 میلی مولار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 52

نمودار 4-6- میزان بیان ژن SOS1 در برگ ژنوتیپ های الموت، ارگ و آجیلوپس…………………………………….. 53

نمودار4 -7- میزان بیان ژنsos1  در ریشه ژنوتیپ های الموت، ارگ و آجیلوپس در زمان های 6،3 و 24 ساعت پس از تنش شوری 150 میلی مولار………………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

نمودار 4-8- میزان بیان ژن  SOS1 در برگ و ریشه الموت در زمان های 6،3 و24 ساعت پس از اعمال تنش شوری 150 میلی مولار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 55

نمودار 4-9- میزان بیان ژن  SOS1 در برگ و ریشه ارگ در زمان های 6،3 و24 ساعت پس از اعمال تنش شوری 150 میلی مولار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 56

نمودار 4-10- میزان بیان ژن  SOS1 در برگ و ریشه آجیلوپس در زمان های 6،3 و24 ساعت پس از اعمال تنش شوری 150 میلی مولار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 57

نمودار 4-11- میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در سه رقم آجیلوپس, ارگ و الموت و در بافت های برگ و ریشه بعد از تنش شوری 150 میلی مولار………………………………………………………………………………………………………………………………………… 59

نمودار 4-12- میزان فعالیت آنزیم پر اکسیداز در سه رقم آجیلوپس, ارگ و الموت و در دو ناحیه برگ (الف)و ریشه (ب)………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 60

نمودار 4-13- میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در سه رقم آجیلوپس, ارگ و الموت و در بافت های  برگ و ریشه پس از اعمال تنش شوری 150 میلی مولار………………………………………………………………………………………………………………………………. 63

نمودار4-14- میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در سه رقم آجیلوپس, ارگ و الموت و در بافت های برگ (الف) و ریشه (ب) 63