%34تخفیف

 بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده H+- ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش ­فلزات سنگین

تعداد83 صفحه در فایل word

کارشناسی ­ارشد در رشته اصلاح نباتات

 بررسی الگوی بیان ژن رمزکننده H+– ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش ­فلزات سنگین

الگوی بیان ژن H+– ATPase غشای پلاسمایی در Aeluropus littoralis تحت شرایط تنش ­فلزات سنگین بذور این گیاه پس از جمع آوری از منطقه پل فسا واقع در جنوب شهر شیراز در گلخانه بخش زراعت و اصلاح نباتات داشکده کشاورزی دانشگاه شیراز کشت شدند. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. پس از گذشت دو ماه تیمار‏های سرب، جیوه، نقره و کلرید سدیم هر کدام در دو سطح اعمال شدند. سپس در چهار بازه زمانی 0، 6، 48 و 72 ساعت پس از تنش نمونه برداری انجام و سریعا نمونه‏ها در نیتروژن مایع قرار داده و سپس تا زمان انجام آزمایش در فریزر 80- نگهداری شدند. نتایج نشان داد که فلزات سنگین مختلف تأثیر متفاوتی روی رشد گیاه و میزان بیان ژن Alha1 دارند. بررسی بیان ژن رمز کننده پمپ پروتونی غشای پلاسمایی نشان داد که در سطح µM50 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به نقره زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 6 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین در سطح µM 100 بیشترین میزان بیان ژن مربوط به تیمار نقره در زمان 72 ساعت و کمترین آن مربوط به سرب در زمان 72 ساعت پس از اعمال تنش بود. همچنین بیان ژن تحت تأثیر کلرید سدیم در دو غلظت mM 200 و mM 400 در همه زمان‏ها افزایش یافت. همچنین مشاهده شد که مقدار فلزات در گیاه بدون تأثیر بر رشد گیاه افزایش یافت. این نتایج نشان می‏دهد که این گیاه ممکن است فلزات سنگین را بخوبی در خود نگه داشته و در این میان ژن Alha1 نقش مهمی بازی می‏کند. به طور کلی می‏توان گفت که میزان بیان ژن در گیاه تحت تأثیر نوع فلز، غلظت فلز، اندام مورد نظر، زمان تنش و شرایط تنش تغییر می‏کند

فهرست مطالب

عنوان                                                                                       صفحه

فصل اول

مقدمه 1

1-1- تنش.. 1

1-2- شوری خاک.. 1

1-3- اثرات شوري بر گياهان.. 2

1-4- تنش فلزات سنگین.. 2

1-4-1- سرب. 4

1-4- 2- جیوه. 4

1-4- 3- نقره. 5

1-5- ویژگی‏های پروتئین‌هاي  H+-ATPaseغشاي پلاسمايي.. 6

1-6- ویژگی‌های گیاه Aeluropus littoralis. 7

1-7- اهداف پژوهش.. 9

فصل دوم

مروری بر پژوهشهای پیشین.. 10

2-1- انتقال پیام در پاسخ به تنش فلزات سنگین.. 10

2-1- 1- سیستم کلسیم/کالمادولین. 10

2-1-2- نقش هورمون‏ها. 11

2-1-3- تنش اکسیداتیو. 11

2-1-4- مسیر MAPK.. 12

2-2- انواع پمپ‌هاي  ATPase. 12

2-3- H+-ATPase و تحمل تنش شوري.. 14

2-4- H+-ATPase و تحمل تنش فلزات سنگین.. 15

فصل سوم

مواد و روش‏ها 17

3-1- جمع آوري نمونه‌ها‌ي گیاهی.. 17

3-2- کاشت بذرها.. 17

3-3- اعمال تیمار.. 18

3-4- محلول هوگلند.. 19

3-5- اندازه‏گیری میزان عناصر.. 20

3-6- طراحي آغازگر.. 21

3-7- استخراج دي‏ان‏ا از نمونه‌ي‌ گیاهی با استفاده از روش CTAB تغييريافته‌   22

3-7-1-تهيه‌ي محلول استخراج. 22

3-7-2- روش کار. 22

3-7-3- محلول شستشوي شماره 1. 24

3-7-4- محلول شستشوي شماره 2. 24

3-8- استخراج آر‌ان‌ا.. 24

3-8-1- روش کار. 24

3-9- سنتز رشته اول cDNA.. 26

3-10- واكنش  RT-PCRبرای ژن‏های  AlHA1و مرجع.. 26

3-11- تهيه ژل آگارز.. 27

3-12- بافر( X50) TAE.. 28

3-12-1- محلول Tris 28

3-12-2- محلول اتيلن دي آمين تترا استيک اسيد (EDTA)   28

3-13- همسانه‌سازي قطعه مورد نظر در پلاسمید.. 29

3-13-1- اتصال قطعه مورد نظر به درون ناقل پلاسمیدی   29

3-13-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری E. coli سویه DH5α  30

3-13-3- انتخاب همسانه‌ها. 31

3-13-4- کشت شبانه‌ي کلنی‌های مثبت. 32

3-13-5- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری به روش لیز کردن آلکالاینی. 32

3-13-6- هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب. 35

3-14- آنالیز‏های آماری.. 36

فصل چهارم

نتايج و بحث.. 37

4-1- آنالیز صفات مورفولوژيک.. 37

4-1-1- وزن ریشه. 37

4-1-2-وزن ساقه. 39

4-1-3- وزن کل گیاه. 40

4-1-4-طول ریشه. 41

4-1-5- طول ساقه. 41

4-1-6-طول کل گیاه. 42

4-2- اندازه‌گيري عناصر در گياه.. 43

4-2-1- جیوه. 44

4-2-2- سرب. 44

4-2-3- نقره. 45

4-3- کميت و کيفيت دي‌ان‌ا استخراج شده.. 46

4-4- استخراج RNA از برگ گیاه A. littoralis. 46

4-5 – واکنش زنجيره‌اي پليمراز PCR .. 47

4-6- بررسي بيان ژن Alha1 تحت تنش فلزات سنگين  و شوری به روش نيمه کمي   48

4-6-1- بررسي اثر سطوح مختلف سرب در زمان‌هاي مختلف پس از اعمال تيمار بر بیان ژن Alha1. 49

4-6-2- بررسي اثر سطوح مختلف نقره در زمان‌هاي مختلف پس از اعمال تيمار بر بیان ژن Alha1. 50

4-6-3- بررسي اثر سطوح مختلف کلرید سدیم در زمان‌هاي مختلف پس از اعمال تيمار بر بيان ژن Alha1. 52

4-6-4- بررسي اثر سطوح مختلف جیوه در زمان‌هاي مختلف پس از اعمال تيمار بر بیان ژن Alha1. 53

4-7- همسانه‌سازي محصول پي‏سي‏آر.. 56

4-8 – نتیجه‏ گیری.. 57

4-9- پیشنهادات.. 58

 شکل‏ها

عنوان                                                                                      صفحه

شکل 1-1- خروجH+  به خارج سلول در اثر فعالیت پمپ  H+– ATPase 6

شکل 3-1- گیاه رشد کرده A. littoralis درون پرلیت پس از 2 ماه. 18

شكل 3-2- اندازه گياه A. littoralis پس از دو ماه بدون اعمال تیمار. 18

شکل 3-3-  ناقل پلاسمیدی pTZ57R/T. 29

شکل 4-1- اثر فلزات مختلف و شوري بر وزن ريشه گیاه .A. littoralis. 39

شکل 4-2- اثر فلزات مختلف و شوري بر وزن ساقه گیاه A. littoralis.. 40

شکل 4-3- اثر فلزات مختلف و شوري بر وزن کل گیاه A. littoralis. 40

شکل 4-4- اثر فلزات مختلف و شوري بر طول ریشه در گیاه  A. littoralis. 41

شکل 4-5- اثر فلزات مختلف و شوري بر طول ساقه A. littoralis.. 42

شکل 4-6- اثر فلزات مختلف و شوري بر طول کل گیاه A. littoralis. 43

شکل 4-7- مقایسه میزان جیوه تجمع یافته در اندام هوایی گیاه با شاهد. 44

شکل 4-8- مقایسه میزان سرب تجمع یافته در اندام هوایی گیاه با شاهد. 45

شکل 4-9- مقایسه میزان نقره تجمع یافته در اندام هوایی گیاه با شاهد. 46

شكل 4-10- دي‏ان‏ا استخراج شده از برگ گیاه A. littoralis با استفاده از روش CTAB 46

شکل 4-11- استخراج آر‌ان‌ا  از برگ A. littoralis 47

شکل 4-12- قطعات تکثير شده ازcDNAs  تهيه شده با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي 48

شکل 4-13- بررسي بيان ژن Alha1 تحت تاثير سرب به روش نيمه کمي. 50

شکل 4-14- بررسي تغييرات بيان ژن Alha1 در مقابل سطوح مختلف سرب در زمان‌هاي مختلف. 50

شکل 4-15- بررسي بيان ژن Alha1 تحت تاثير نقره به روش نيمه کمي. 51

شکل 4-16- بررسي تغييرات بيان ژن Alha1 در مقابل سطوح مختلف نقره در زمان‌هاي مختلف. 52

شکل 4-17- بررسي بيان ژن Alha1 تحت تاثير کلرید سدیم به روش نيمه کمي. 53

شکل 4-18- بررسي تغييرات بيان ژن Alha1 در مقابل سطوح مختلف کلرید سدیم در زمان‌هاي مختلف. 53

شکل 4-19- بررسي بيان ژن Alha1 تحت تاثير جیوه به روش نيمه کمي. 54

شکل 4-20- بررسي تغييرات بيان ژن Alha1 در مقابل سطوح مختلف جیوه در زمان‌هاي مختلف. 54

شکل 4-21- الکتروفورز استخراج پلاسمید 56

شکل 4-22- تکثیر قطعه مورد نظر از پلاسمید استخراج شده 57

جداول

عنوان                                                                                      صفحه

جدول 3-1-  عناصر تشکیل دهنده محلول هوگلند. 19

جدول 3-2- تيمارهاي اعمال شده در دو غلظت. 20

جدول 3-3- آغازگر‏های مورد استفاده در این تحقیق همراه با مشخصات و توالی آن‏ها. 21

جدول 3-4- تهیه‌ي محلول استخراج دی‌ان‌ا. 22

جدول 3-5- مواد مورد نياز براي ساخت محلول شتشوي شماره 1. 24

جدول 3-6- مواد مورد نياز براي ساخت محلول شستشوي شماره 2. 24

جدول 3-7-  مواد مورد استفاده در  سنتز cDNA. 26

جدول 3-8- چرخه‌ دمایی در واكنش  RT-PCRژنAlHA1  و ژن رمز کننده Actin. 27

جدول 3-9- مواد مورد استفاده در واكنش پي‌سي‌آر و میزان‌های مورد استفاده. 27

جدول 3-10- مواد تشکيل دهنده بافر TAE. 28

جدول 3-11- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واکنش اتصال. 30

جدول 3-12- چرخه‏های دمایی واکنش کلنی‏ پی‏سی‏آر. 31

جدول 3-13- محتوای محیط کشت LB مایع 7 pH=. 32

جدول 3-14- تهیه‌ي محلول شماره‌ي І. 33

جدول 3-١5- تهیه‌ي محلول شماره‌ي II. 33

جدول 3-١6- تهیه‌ي محلول شماره‌ي III. 34

جدول 3-17- واکنش هضم آنزیمی. 35

جدول 4-1- نتایج تجزیه واريانس صفات مورفولوژيک. 37

جدول 4-2- مقايسه صفات مورفولوژيک مورد مطالعه تحت تنش فلزات مختلف به روش آزمون چند دامنه‏اي دانکن. 38

جدول 4-3- نتایج تجزیه واريانس میزان عناصر سنگین موجود در اندام هوایی گیاه تحت تیمار‏های مختلف. 43

جدول 4-4- مقایسه میانگین میزان فلزات سنگین در اندام هوایی گیاه به روش آزمون چند دامنه‏ای دانکن. 44

جدول 4-5- نتایج تجزیه واريانس میزان بیان ژن تحت تنش فلزات سنگین. 49

قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
Loading...
enemad-logo