بررسی ارتباط چند شکلی های ژنتیکی ژن های XRCC6 (Ku70) و XRCC5 (Ku80) با خطر ابتلا به سرطان پستان

عنوان                                                                                           صفحه

فصل اول: مقدمه …………………………………………………………………………………………………………………………….1

• مقدمه ای بر سرطان پستان ………………………………………………………………………………………………..3

• عوامل خطر سرطان پستان ………………………………………………………………………………………………….4

1-2-1- سن ………………………………………………………………………………………………………………………..5

1-2-2- قاعدگی زودرس و یائسگی دیررس ………………………………………………………………………5

1-2-3- سن در اولین بارداری ……………………………………………………………………………………………6

1-2-4- میزان شیردهی ……………………………………………………………………………………………………..6

1-2-5- سابقه شخصی از لحاظ آسیب شناسی بافت پستان …………………………………………….6

1-2-6- مصرف سیگار ………………………………………………………………………………………………………..7

1-2-7- مصرف الکل …………………………………………………………………………………………………………..7

1-2-8- مصرف داروهای هورمونی ……………………………………………………………………………………..7

1-2-9- سابقه خانوادگی …………………………………………………………………………………………………….8

• ژنتیک سرطان پستان ………………………………………………………………………………………………………….8

1-3-1- شکست های دو رشته ای DNA ……………………………………………………………………….9

1-3-2- مسیر ترمیمی Non – Homologous End Joining (NHEJ) …………..10

• ژن XRCC6 (Ku70) ………………………………………………………………………………………………….11

• ژن XRCC5 (Ku80) ………………………………………………………………………………………………….12

• هدف ………………………………………………………………………………………………………………………………….14

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده ………………………………………………………………………………15

2-1-    مطالعات انجام شده بر روی ارتباط چندشکلی ژنتیکی T-991C (rs5751129) در

            ناحیه پروموتر ژن XRCC6 با خطر ابتلا به بیماری ها ……………………………………………….16

2-2-    مطالعات انجام شده بر روی ارتباط چندشکلی ژنتیکی  VNTR (rs6147172) در

            ناحیه پروموتر ژن XRCC5 با خطر ابتلا به بیماری ها ……………………………………………….17

2-3-    فرضیه ……………………………………………………………………………………………………………………………….19

فصل سوم: روش انجام کار …………………………………………………………………………………………………………20

3-1-    نمونه گیری ……………………………………………………………………………………………………………………….21

3-2-    وسایل مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………..22

3-3-    مواد مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………23

           3-3-1- محلول های لازم جهت استخراج DNA …………………………………………………………23

           3-3-2- مواد لازم جهت انجام PCR …………………………………………………………………………….23

           3-3-3- مواد لازم جهت انجام الکتروفورز ………………………………………………………………………23

           3-3-4- مواد لازم جهت اثر دادن آنزیم محدود کننده ………………………………………………….24

           3-3-5- مواد لازم جهت انجام Real time PCR ………………………………………………………24

3-4-    تهیه محلول ها ………………………………………………………………………………………………………………….24

3-5-    استخراج DNA از خون محیطی به روش جوشاندن (Boiling method) ………………25

3-6-    واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) …………………………………………………………………………………26

3-7-    الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………………….29

3-8-    رنگ آمیزی ژل …………………………………………………………………………………………………………………30

3-9-    High Resolution Melting (HRM) Analysis ……………………………………………..30

           3-9-1- Preamplification ………………………………………………………………………………………30

           3-9-2- ذوب DNA ………………………………………………………………………………………………………32

           3-9-3- آنالیز …………………………………………………………………………………………………………………..33

3-10-  تحلیل آماری …………………………………………………………………………………………………………………….33

فصل چهارم: نتایج ……………………………………………………………………………………………………………………….34

4-1-    مشخصات افراد شرکت کننده در مطالعه …………………………………………………………………………35

4-2-    نتایج حاصل از بررسی عوامل خطر کیفی دخیل در سرطان پستان ……………………………….35

4-3-    نتایج حاصل از بررسی عوامل خطر کمی دخیل در سرطان پستان ………………………………..37

4-4-    نتایج حاصل از بررسی چندشکلی T-991C در ژن XRCC6 …………………………………….37

           4-4-1- مقایسه فراوانی های ژنوتیپی و آللی بین دو گروه شاهد و بیمار ……………………..39

           4-4-2- مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی T-991C ژن XRCC6، بین دو گروه

                      شاهد و بیمار، پس از تعدیل عوامل خطر سرطان پستان …………………………………40

4-5-    نتایج حاصل از بررسی چند شکلی ژنتیکی VNTR (rs6147172)  در ناحیه پروموتر

           ژن XRCC5 …………………………………………………………………………………………………………………..42

           4-5-1- مشاهده 3  الگوی جدید  در نتایج حاصل از بررسی  آنالیز HRM   تعدادی از

                      نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………….44

           4-5-2- نتایج حاصل از تعیین توالی قطعات DNA …………………………………………………….44

           4-5-3- نتایج  حاصل  از  آنالیز  HRM  با  در  نظر  گرفتن  تکرار  جدید  چند شکلی

                       VNTR…………………………………………………………………………………………………………….45

           4-5-4- فراوانی های ژنوتیپی  و  آللی چندشکلی ژنتیکی VNTR (rs6147172) در

                      ناحیه پروموتر ژن XRCC5 در دو گروه شاهد و بیمار ……………………………………46

           4-5-5- مقایسه فراوانی های ژنوتیپی و آللی چندشکلی ژنتیکی VNTR ژن XRCC5

                      در دو گروه شاهد و بیمار …………………………………………………………………………………..48

           4-5-6- مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی VNTR ژن XRCC5،  بین دو  گروه

                      شاهد و بیمار، پس از تعدیل عوامل خطر سرطان پستان…………………………………..49

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری ……………………………………………………………………………………………….52

               پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………..56

فصل ششم: منابع ………………………………………………………………………………………………………………………..58

فهرست جداول

عنوان و شماره                                                                                صفحه

جدول 3-1- مشخصات جمعیت مورد مطالعه ……………………………………………………………………………….21

جدول 3-2- مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR ……………………………………………………27

جدول 3-3- برنامه تنظیم شده برای واکنش PCR جهت تکثیر ژن XRCC6 ………………………..28

جدول 3-4- قطعات حاصل از هضم آنزیمی برای ژنوتیپ های چندشکلی ژنتیکی T-991C ژن

                XRCC6 …………………………………………………………………………………………………………………..29

جدول 3-5- مواد مورد نیاز جهت تهیه مخلوط واکنش PCR جهت انجام آنالیز HRM …………31

جدول 3-6- برنامه تنظیم شده  برای واکنش PCR جهت انجام آنالیز HRM  قطعه مورد نظر

                ژن XRCC5 …………………………………………………………………………………………………………….32

جدول 4-1- بررسی عوامل خطر کیفی دخیل در سرطان پستان ………………………………………………..36

جدول 4-2- بررسی عوامل خطر کمی دخیل در سرطان پستان ………………………………………………….37

جدول 4-3- فراوانی های  ژنوتیپی و آللی چند شکلی ژنتیکی T-991C ژن XRCC6،  در دو

                گروه شاهد و بیمار………………………………………………………………………………………………………39

جدول 4-4- مقایسه فراوانی های ژنوتیپی و آللی چندشکلی T-991C  ژن XRCC6، بین دو

                گروه شاهد و بیمار………………………………………………………………………………………………………39

جدول 4-5- مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چند شکلی T-991C ژن XRCC6،  پس از تعدیل

                سن به عنوان عامل خطر ……………………………………………………………………………………………40

جدول 4-6- مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی  T-991C ژن XRCC6،  پس از تعدیل

                وضعیت تأهل به عنوان عامل خطر ……………………………………………………………………………40

جدول 4-7- مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی T-991C ژن XRCC6،  پس  از تعدیل

                وضعیت یائسگی به عنوان عامل خطر ……………………………………………………………………….41

جدول 4-8- مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چند شکلی  T-991C ژن XRCC6، پس از تعدیل

                سابقه خانوادگی به عنوان عامل خطر ………………………………………………………………………..41

جدول 4-9- مقایسه فراوانی های ژنوتیپی چند شکلی  T-991C ژن XRCC6، پس از تعدیل

                وضعیت استعمال دخانیات به عنوان عامل خطر ……………………………………………………….42

جدول 4-10- فراوانی های  ژنوتیپی و آللی چندشکلی  ژنتیکی VNTR ژن XRCC5، در دو

                گروه شاهد و بیمار ……………………………………………………………………………………………………..47

جدول 4-11- مقایسه  فراوانی های ژنوتیپی و آللی چندشکلی VNTR ژن XRCC5، بین دو

                گروه شاهد و بیمار………………………………………………………………………………………………………48

جدول 4-12- مقایسه  فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی VNTR ژن XRCC5،  پس از تعدیل

                سن به عنوان عامل خطر…………………………………………………………………………………………….49

جدول 4-13- مقایسه  فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی VNTR ژن XRCC5،  پس از تعدیل

                وضعیت تأهل به عنوان عامل خطر ……………………………………………………………………………49

جدول 4-14- مقایسه  فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی VNTR ژن XRCC5،  پس از تعدیل

                سابقه خانوادگی به عنوان عامل خطر ………………………………………………………………………..50

جدول 4-15- مقایسه  فراوانی های ژنوتیپی چندشکلی VNTR ژن XRCC5،  پس از تعدیل

                استعمال دخانیات به عنوان عامل خطر …………………………………………………………………….51

فهرست شکل ها

عنوان و شماره                                                                                صفحه

شکل 1-1- مسیر های ترمیمی NHEJ و HR …………………………………………………………………………..11

شکل 1-2- عناصر تنظیمی cis و چندشکلی ژنتیکی VNTR در پروموتر ژن XRCC5 ……….13

شکل 4-1- نتایج حاصل از PCR/RFLP چندشکلی ژنتیکی T-991C  ژن XRCC6،  قابل

              مشاهده بر روی ژل آگاروز ……………………………………………………………………………………………38

شکل 4-2- منحنی های  ذوب  به  دست  آمده  برای 6  ژنوتیپ   چند شکلی   VNTR   ژن

               XRCC5 ……………………………………………………………………………………………………………………..43

 شکل 4-3- منحنی هایDifference plot وDerivative plot برای6  ژنوتیپ  چندشکلی

              VNTR ژن XRCC5 ……………………………………………………………………………………………….43

شکل 4-4- تصویری شماتیک از چندشکلی ژنتیکی VNTRو واحدهای تنظیمی cis در ناحیه

              پروموتر ژن XRCC5 با در نظر گرفتن تکرار یافت شده جدید …………………………………45

شکل 4-5- نتایج آنالیز HRM 9 ژنوتیپ چندشکلی VNTR ژن XRCC5 ………………………….46