%40تخفیف

بررسی اثر سیتوتوکسیسیتی عصاره قارچی Pleurotus ostreatus روی سلول¬های اریترولوسمی (KG-1)

بررسی اثر سیتوتوکسیسیتی عصاره قارچی Pleurotus ostreatus روی سلول¬های اریترولوسمی (KG-1)

تعداد119صفحه در فایل word

چكيده

سرطان یکی از عوامل شایع مرگ و میر در سراسر دنیاست که بیش از یک سوم جمعیت دنیا را درگیر میکند و عامل بیش از 20% مرگ و میر در دنیا می باشد. مطالعه حاضر اثر ضد سرطانی قارچ خوراکی Pleurotus ostreatus را روی سلولهای سرطانی اریترولوسمی بررسی میکند. اثرات سیتوتوکسیسیتی عصاره متانولی قارچ خوراکی روی سلولهای KG-1 به منظور تعیین حداقل دوز مهارکننده (MIC) با استفاده از تست MTT تعیین شد. به منظور بررسی اثر آن روی سلولهای لوکمیک Jurkat به عنوان سلولهای لوسمی لنفوسیتی حاد و سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان به عنوان کنترل سلول نرمال از تست MTT استفاده شد. سلولهای KG-1 با استفاده از رنگ آمیزی گیمسا از نظر مرفولوژیکی بررسی شدند. سپس جهت بررسی دقیقتر مرگ سلولی از تست فلوسیتومتری با رنگ آمیزی (Annexin V, PI) استفاده شد. با استفاده ازTrans-well assay اثر مهاری عصاره قارچی بر حرکت و تهاجم سلولهای سرطانی بررسی شد و در نهایت بیان ژنهای BAX و MMP-9 جهت بررسی اثر عصاره قارچی روی بیان ژن سلولهای سرطانی اندازه گیری شد.

با آنالیز نتایج تست MTT روی سلولهای KG-1 حداقل دوز مهارکننده رشد سلولی mg/ml1تعیین شد. مطالعه روی سلوهای سرطانی نشان داد که 24 ساعت بعد از مجاورت با عصاره قارچی، القا آپوپتوز و مرگ سلولی در سلولهای سرطانی صورت میگیرد و در عین حال مهاجرت و تهاجم سلولهای سرطانی کاهش مییابد. بررسی بیان ژنBAX روند دوگانه کاهشی و افزایشی را نشان داد و در عین حال باعث کاهش بیان ژن MMP-9 شد. در عین حال دوز mg/ml1روی سلولهای نرمال اثر مهاری نداشت ولی باعث مهار رشد سلولهای سرطانی رده لنفوئیدی شد.

با توجه به نتایج بدست آمده میتوان از ترکیبات موجود در قارچ Pleurotus ostreatus به عنوان داروی گیاهی برای درمان لوسمی به عنوان داروی موثر نسبت به داروهای شیمی درمانی بهره گرفت.

کلیدواژه‌ها: Pleurotus ostreatus، اریترولوسمی، آپوپتوز، متاستاز ،BAX و MMP-9

دسته: زیست شناسی, علوم تجربی برچسب: BAX و MMP-9, آپوپتوز, اریترولوسمی, کلیدواژه‌ها: Pleurotus ostreatus, متاستاز

توضیحات

فهرست مطالب

فصل اول : مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته 1

1-1. سرطان 2

1-1-1. میزان شیوع 4

1-1-2. روشهای درمانی 5

1-2. لوسمی 6

1-2-1. شیوع لوسمی 8

1-2-2. تشخیص و درمان 8

1-3. لوسمی میلوئیدی حاد (AML) 8

1-3-1. شیوع AML 11

1-3-2. علایم بیماری AML 11

1-3-3. تشخیص 12

1-3-4. پیش آگهی 12

1-3-5. درمان لوسمی میلوئیدی حاد 13

1-4. اریترو لوسمی یا AML-m6 14

1-4-1. شیوع اریترولوسمی 15

1-4-2. پیش آگهی 15

1-4-3. درمان 15

1-5. سلول 16

1-5-1. KG-1 16

1-5-2. سلول Jurkat 17

1-5-3. سلول ((BM-MSCs 17

1-6. گیاه درمانی 17

1-6-1. قارچهای خوراکی 18

1-6-2. Pleurotus ostreatus 20

1-7. آپوپتوز 22

1-7-1. ژن Bax ( Bcl-2 associated X protein) 27

1-8. MMP 27

1-8-1. پروتئین MMP-9 28

1-9. مروری بر مطالعات گذشته 28

1-10. سوالات 30

1-11. اهداف 31

فصل دوم : مواد و روشها 32

2-1. مواد و وسایل مورد نیاز 33

2-1-1. مواد مصرفی 33

2-1-2. وسایل مصرفی 33

2-1-3. کیت های مورد استفاده 34

2-1-4. دستگاهها 34

2-2. تهیه بافرها 36

2-2-1. تهیه بافر PBS 1X 36

2-2-2. تهیه بافر TAE 50X 36

2-3. کشت سلول 37

2-4. استخراج عصاره متانولی قارچPleurotus ostrestus 37

2-5. آمادهسازی سوسپانسیون عصاره قارچی 38

2-6. آزمایشات 38

2-6-1. آزمایش MTT 38

2-6-2. تهیه Smear و رنگآمیزی گیمسا 40

2-6-3. تستInvasion assay 41

2-6-4. بررسی میزان بیان ژنهای MMP-9و BAX 43

2-6-4-1. طراحی پرایمر 43

2-6-4-2. آمادهسازی سلولها برای استخراج RNA 44

2-6-4-3. استخراج RNAبا استفاده از RNX-plus 44

2-6-4-4. سنتز cDNA با استفاده ازکیت شرکت سیناژن 45

2-6-4-5. پروتکل 46

2-6-4-6. واکنش زنجیرهای پلیمرازی PCR 47

2-6-4-7. بررسی کیفی محصولات حاصل از PCR 50

2-6-4-8. Real time PCR 50

2-6-5. فلوسیتومتری 53

2-6-5-1. پروتکل 54

2-7. آنالیز آماری 55

فصل سوم : نتايج و يافته ها 56

3-1. نتایج حاصل از تاثیر عصاره قارچی Pleurotus ostreatus بر سلولهای KG-1 با استفاده از تست MTT 57

3-2. تصاویر مربوط به مقایسه سلولهای مجاور شده با عصاره قارچی با غلظتهای mg/ml (100و10) با سلولهای نمونه کنترل. 59

3-3. بررسی اثر مهاری غلظت mg/ml1 عصاره قارچی روی سلولهای BMSC وJurkat . 61

3-4. نتایج حاصل از رنگآمیزی سلولهای KG-1 با رنگ گیمسا در زمانهای مختلف و مقایسه آن با نمونه کنترل. 62

3-5. نتایج Invasion assay 64

3-6. نتایج بررسی بیان ژنهای BAX وMMP-9 65

3-6-1. نتایجPCR 65

3-6-2. نتایج Real time 66

3-6-2-1. نتایج مربوط به بیان ژن MMP-9 66

3-6-2-2. نتایج مربوط به بیان ژن Bax به منظور بررسی اثر عصاره قارچی بر مسیر داخلی آپوپتوز 66

3-6-2-3. نمودارهای Melting curve مربوط به ژنهای Bax،MMP-9 وAct-β 67

3-7. نتایج فلوسیتومتری جهت بررسی آپوپتوز سلولها با استفاده ازAnnexin Vو.PI 69

فصل چهارم : بحث، نتيجه گيري و پيشنهادها 72

4-1. بحث 73

4-2. نتیجه گیری و پیشنهادات 78

فهرست منابع 79

Abstract 84

فهرست شکل ها

شکل 1-1. میزان شیوع موارد جدید و میزان مرگ ومیر مربوط به بدخیمی های مختلف در دنیا [9]. 5

شکل 1-2. جهش در سلولهای هماتوپوئیتیک باعث ایجاد کلونی لوکمیک شده و با تقسیم کلنی ها لوسمی کسترش پیدا میکند [14]. 9

شکل 1-3. خلاصه ای از مکانیسم اثر ترکیبات بیواکتیو قارچهای خوراکی [27]. 20

شکل 1-4. قارچ خوراکی، درختی Pleurotus ostreatus 21

شکل 1-5. تصویر شماتیک اختلافات مرفولوژیک سلولهای در حال آپوپتوزبا سلولهای در حال نکروز [21]. 24

شکل1-6. تصویر شماتیک اختلافات مرفولوژیک سلولهای در حال آپوپتوز با سلولهای درحال نکروز [42]. 26

شکل 2-1. تصویر شماتیک از جزئیات تست Invasion assay همراه با پلیت مخصوص تست. 43

شکل 3-1.سلولهای رده میلوئیدی با اندازه های مختلف سلولی KG-1 قبل از مجاورت با عصاره قارچی (A) و سلولهای تخریب شده بعد از مجاورت با دو mg/ml 10عصاره قارچی (B) سلولهای تخریب شده بعد از مجاورت با mg/ml100 عصاره قارچی(C) .سلولهای نمونه کنترل که بعد از گذشت 24 ساعت تکثیر شده و به صورت خوشه ای در آمده اند(D) سلولهای مجاور شده با عصاره قارچی با دوز mg/ml 10بعد از گذشت 24 ساعت(E) تصویر سلولهای مجاور شده با عصاره قارچی با دوز mg/ml 100 بعد از گذشت 24 ساعت(F) . 60

شکل 3-2. رنگ آمیزی گیمسا روی سلولهای لوکمیک،تصاویر A-F به ترتیب مر بوط به سلولهای کنترل، 2، 6، 24،48 و72 ساعت بعد از مجاورت با عصاره قارچی میباشد.تصاویر G وF متعلق به سلولهای حرارت دیده بعد از 24و 48 ساعت می باشد. 64

شکل 3-3. تصویر مربوط به الکتروفورز نمونه های حاصل از PCR برای بررسی کیفی 65

شکل 3-4. جمعیت سلولی انتخاب شده جهت آنالیز برای تفکیک جمعیت های مختلف 70

شکل 3-5. نتایج فلوسیتومتری نمونههای کنترل (A) ، تست بعد از 24 ساعت از مجاورت با عصاره قارچی (B) و بعد از 48 ساعت از مجاورت با عصاره قارچی (C) بعد از آنالیز با نرم افزار Flowjo همراه با نمونه کنترل مثبت (D) ]به مدت 1 ساعت مجاور شده با حرارت 44̊Cو انکوبه شده تا 72 ساعت[. 70

فهرست جداول

جدول 1-1. تقسیم بندی لوسمی میلوئیدی حاد براساس معیارهای FAB. 9

جدول 1-2. تقسیم بندی لوسمی میلوئیدی حاد براساس معیارهای WHO. 10

جدول 1-3. پیش آگهی اختلالات سیتوژنتیک در AMLبالغین 12

جدول 2-1. توالی پرایمرهای اختصاصی مربوط به mRNA اختصاصی. 43

فهرست نمودارها

نمودار 3-1. نتایج مربوط به تست MTT همراه با میانگین OD حاصل از تست MTT در طول موج 570 nm در دوزها و زمانهای مختلفتفاوت معناداری بین گرووها با علامت های روی نمودار با P <0.05 نشان داده شده است. 58

نمودار 3-2. نتایج تست MTT مربوط به اثر عصاره قارچی mg/ml1 به سلولهای Jurkat و BMSCs.(P<0.05) 61

نمودار 3-3. مقایسه میزان تهاجم سلولهای مجاور شده با عصاره قارچی mg/m1 با سلولهای نمونه کنترل همراه با جدول میانگین تعداد سلولهای مهاجرت کرده. 64

نمودار 3-4. میزان بیان ژن MMP-9 و Bax درسلولهای KG-1 بعد از مجاورت با عصاره قارچی mg/ml 1در زمانهای مختلف. 67

نمودار 3-5. نمودار Melting curve مر بوط به ژن C)̊BAX (87.17 68

نمودار 3-6. نمودار Melting curve مر بوط به ژن MMP-9 (87.55̊C) 68

نمودار 3-7. نمودار Melting curve مر بوط به ژن Act-β (86.77̊C) 68

نمودار3-8. نمودارهای مربوط به آنالیز داده های فلوسیتومتری با استفاده از تست ANOVA-Tukey بر اساس مثبت یا منفی بودنAnnexin V و PI. 71

امتیاز 0 از 5 از 0 دیدگاه

قیمت اصلی: 35,000 تومان بود.قیمت فعلی: 21,000 تومان.

تاریخ ایجاد آذر 9, 1399
تاریخ بروزرسانی اسفند 13, 1401
فروش 0
دیدگاه 0

شرایط استفاده از محصول

تمام محصولات به ازای پرداخت پروژه تنها قابل استفاده می باشند. این بدین معنی است که برای استفاده از یک یا چند محصول ، لازم به خرید آن محصول است.

مزایای خرید این محصول:

دسترسی به فایل به صورت همیشگی
پشتیبانی رایگان
پشتیبانی 24 ساعته محصول
بازگشت وجه در صورت عدم رضایت مشتری

مشاهده قوانین سایت