1-1 اريتروپويتين. 2
1-1-1 ساختماناريتروپويتين: 2
1-1-2- انواعاريتروپويتين. 8
1-1-3- فعاليتاريتروپويتين. 8
1-1-4- بافتهايتوليدکننده: 10
1-1-5- اثرحفاظتیاریتروپویتینبرسلولهایعصبی.. 10
1-2- آستروسيتها 12
1-2-1نقشآستروسيتهادربيماريهايزوالعصبي: 14
1-2-2آستروسيتهادربيماريآلزايمر: 15
1-3- بيماريآلزايمر. 16
1-3-1- تاريخچهواهميتبيماري.. 16
1-3-2- علايمومراحلبيماري.. 17
1-3-3- مکانيسمهايمولکوليبيماريآلزايمر (مرورکلي). 18
1-4- تجمعپروتئين. 19
1-5- تجمعاتآميلوئيدي.. 20
1-5-1- تشکيلآميلوئيد. 20
1-5-2- بيماريهايآميلوئيدي.. 21
1-6- مکانيسمتوليدپپتيدآميلوئيدبتا 22
1-6-1- ويژگيهايپپتيدآميلوئيدبتا 24
1-7-مکانيسمهايسميتپپتيدآميلوئيدبتا 25
1-7-1- توليدراديکالدرمغزوايجاداسترساکسيداتيو. 25
1-7-2- تشکيلمنفذ. 26
1-7-3-ميانکنشباتاو. 26
1-7-4-اتصالبهApo E. 27
دو |
1-7-5-اتصالبهکاتالاز. 28
1-7-6- آميلوئيدبتاوالتهاب.. 28
1-8- آميلوئيدبتاومرگسلولي.. 28
1-9- هدفازانجامپژوهش… 29
2-1- موادوروشها: 31
2-1-1 موادلازم. 31
2-1-2دستگاههايموردنياز: 31
2-2-توليداريتروپويتيننوترکيب.. 32
2-2-1-کشتسلولCHO: 32
2-2-2-کروماتوگرافيSize-exclusion: 33
2-2-3- کروماتوگرافيتعويضيوني: 35
2-2-4- کروماتوگرافيژلفيلتراسيونبادرجهيHPLC: 35
2-2-5- تعيينغلظتبهروشبير-لامبرت.. 35
2-2-6- تعيينغلظتبهروشبرادفورد: 35
2-2-7-روشالکتروفورزبرايتعيينخلوصپروتئيناستخراجشده: 37
2-2-7- روشکروماتوگرافیمایعباکاراییبالایفازمعکوس(RP_HPLC)برايتعييننقشهپپتيدي.. 45
2-2-8- روشالكتروفورزمويينناحيهايCZE: 47
2-3-کشتدوبعدي(2D)وسهبعدي(3D)آستروسيتها: 48
2-3-1-دفريزکردنسلولها: 48
2-3-2تعويضمحيطکشتسلول: 49
2-3-3کشت3Dسلولها: 49
2-4-آمادهسازيپپتيدآميلوئيدبتا: 50
2-4-1- بررسیاثرسمیتآمیلوئیدبااستفادهازمیکروسکوپاینورت: 50
2-5-تستگذاريسلولها: 50
2-5-1-تستMTT: 50
2-5-2-تستLDH: 51
سه |
2-6- مطالعهبرهمكنشاريتروپويتيناسيديودايمرباآميلوئيدبتا 52
2-6-1 بررسيتشکيلفيبريلهايآميلوئيدبااستفادهازطيفسنجيفلورسانس… 52
2-6-2- بررسيبرهمكنشاريتروپويتينوآميلوئيدبتابااستفادهازروشالكتروفورزSDS. 53
2-6-3- مطالعاتاسپکتروپلاريمتري (دورنگنماييدوراني) درناحيةفرابنفشدور. 53
2-6-4- روشپراكندگينورديناميكي(DLS)برایاندازهگیریسایزذرات: 54
3-1- استحصالاریتروپویتین. 57
3-1-1- کشتسلولهایCHO.. 57
3-1-2- استخراجاریتروپویتین. 57
3-1-2-1 کروماتوگرافیژلفیلتراسیون. 58
3-1-2-2 كروماتوگرافيتعويضيوني.. 58
3-1-2-3 ژلفيلتراسيونبادرجهHPLC. 59
3-1-3 تأییدمراحلاستخراجاریتروپویتینباالکتروفورزSDS-PAGE.. 60
3-1-4- تعيينخلوصپروتئيناستخراجشده. 61
3-1-5- تعيينغلظتپروتئین. 61
3-1-5-1-تعيينغلظتپروتئینبااستفادهازقانونبیر-لامبرت 61
3-1-5-2تعيينغلظتپروتئینبااستفادهازروشبرادفورد. 62
3-1-6- نقشهپپتيدي.. 63
3-1-7- نتايجمربوطبهكروماتوگرافيمويينناحيهاي(CZE): 64
3-2-نتايجمربوطبهاثرEpoاسيديودايمربرمرگسلوليحاصلازآميلوئيدبتادرسلولهايآستروسيت.. 64
3-2-1- تعیینغلظتیازآمیلوئیدبتاکهسمیتبیشتریبرسلولهایآستروسیتدارد. 65
3-2-2-بررسیاثرسمیتآمیلوئیدبتابرسلولهایآستروسیت.. 65
3-2-3 مطالعهاثراریتروپویتینبرمیزانبقاءآستروسیتهادربرابرسمیتآمیلوئیدبتا 66
3-2-3-1- تستMTTدركشتدوبعدي.. 66
3-2-3-2- تستLDHدركشتدوبعدي.. 67
3-2-2-3 تستMTTدركشتسهبعدي(3D). 68
3-2-2-4 تستLDHدركشتسهبعدي(3D). 69
چهار |
3-2-2-5- مقایسهنتايجتستهایMTTوLDHبرايكشتهايدوبعديوسهبعدی.. 70
3-3- برهمکنشاريتروپويتينباآميلوئيدبتادرIn vitro. 72
3-3-1- بررسياسپکتروفلوريمتري (بررسينشرفلورسانستيوفلاوينT). 72
3-3-2- مطالعهبرهمكنشاريتروپويتينوآميلوئيدبتابهوسیلهالکتروفورز: 73
3-3-3- نتيجهبررسيطيفCD: 73
3-3-4- نتيجهبررسياندازهذراتتوسطدستگاهDLS. 75
4-1 بحث. 79
4-1-1- اختلافدرکشتدوبعدیوسهبعدی.. 80
4-1-2- تفاوتاریتروپویتینمونومرودایمردرمواجههباسمیتآمیلوئیدبتا 80
4-2- نتيجهگيري. 82
منابع: 84
پنج |
فهرست اشکال
شكل 1-1: ساختماناولاريتروپويتينانسانيوسكانساسيدآمينه ( باحضورآرژنين 166). 3
شكل 1-2: ساختمانسوماريتروپويتين. 4
شكل 1-3: دياگرامنواريوساختمانچهارماريتروپويتينانساني. 4
شکل 1-4: ساختارقندياريتروپويتينانساني.. 6
شکل1-5: زنجيره‌هايقنديمتصلبهNرايجدراريتروپويتينانسانينوترکيب.. 7
شکل 1-6: آستروسيتهيپوکمپموش… 13
شکل 1-7: تصويرآستروسيتهادرکنارپلاکهايآميلوئيدبتا. 15
شکل 1-8: مکانيسمهايمولکوليبيماريآلزايمر. 19
شکل 1-9: تجمعپروتئين. 19
شکل 1-10:سلسلهمراتبتشکيلفيبريلآميلوئيد. 21
شکل 1-11: مسيرهايپردازشيآميلوئيدوژنيکوغيرآميلوئيدوژنيکپروتئينپيشسازآميلوئيدبتا 22
شکل 1-12: اثراتزيانبارتجمعاتآميلوئيديدرونسلولي.. 23
شکل 1-13: تواليآمينواسيديوجايگاههايبرشپپتيد 42-1 Aβ. 24
شکل 1-14: تواليهايآمينواسيديموثردرفرايندتشخيصبينمولکوليبرايشروعشکل‌گيريفيبريل. 24
شکل 1-15: شماييازچرخهمضردرحالتکراردرمسيربيماريزاييآلزايمر. 26
شکل 1-16:ديناميکاتصالتاوبهميکروتوبول. 27
شکل 2-2: اساسالکتروفورزمویین. 48
شکل 2-3. ميانکنشتيوفلاوينTباصفحاتβدرتجمعاتآميلوئيدي.. 52
شكل 3-1: ژلمربوطبهکشتسلولهایCHOلیزشده. 57
شكل 3-2: كروماتوگراممربوطبهژلفيلتراسيون. 58
شكل 3-3: كروماتوگراممربوطبهكروماتوگرافيتعويضيوني.. 59
شكل 3-4: كروماتوگراممربوطبهژلفيلتراسيونبادرجهHPLC.. 60
شکل3-5 شکلژلالکتروفورزمراحلمختلفاستخراجاریتروپویتین. 60
شكل 3-6: شكلمربوطبهتعييندرصدخلوصاریتروپویتینمونومربابرنامهUVIPhoto MW… 61
شكل 3-7: شكلمربوطبهتعييندرصدخلوصاریتروپویتیندایمربابرنامهUVIPhoto MW… 61
شكل 3-8: كروماتوگراممربوطبهتطبيقنقشهپپتيديEpoتخليصشدهبانمونهاستاندارد. 64
شكل 3-9: كروماتوگرامCZEبراياريتروپويتين. 64
شکل 3-10 نمودارمربوطبهسمیتAβ25-35درغلظتهای 5/0 ، 5 و 50 میکرومولاربرسلولهایآستروسیتدر 24 ساعتدرکشتدوبعدی. 65
شکل 3-11 تصویرسلولهایآستروسیتبدونحضورودرحضور
شش |
Aβ25-35. 66
شكل 3-12: نمودارتستMTTكشت2Dآستروسيتهادرحضورa) Epoاسيديوb) Epoدايمردر 24، 48 و 72 ساعت. 67
شكل 3-13: نمودارمربوطبهتستLDHكشت2Dآستروسيتهادرحضورa) Epoاسيديوb ) Epoدايمردر 24، 48 و 72. 68
شکل 3-14 نمودارMTTمربوطبهکشتسهبعدیآستروسیتهاکهباآمیلوئیدبتاسمیشدهاندa) درحضور. 69
شكل 3-15: نمودارتستLDHكشت3Dآستروسيتهادرحضورa) Epoاسيديوb ) Epoدايمردر 24، 48 و 72 ساعت.. 70
شكل 3-16: نموداردرصدبقاسلولهادربرابرسمیتآمیلوئیدبتادرحالتدوبعدیوسهبعدی.. 71
شكل3-17: نمودارتستaggregation برايآميلوئيدبتا (μM50) درحضوروبدونحضوراريتروپويتين. 72
شكل3-18: ژلالكتروفورزمربوطبهبرهمكنشاريتروپويتينباآميلوئيدبتا 73
شكل3-19: نمودارطیفCDآميلوئيدبتاواريتروپويتينمونومر. 74
شكل3-20: نمودارطیفCDآميلوئيدبتاواريتروپويتيندایمر. 75
شکل 3-21 طیفمربوطبهMSDفیبریلهایآمیلوئیدبتا (غلظتنهاییμM 50) کهپساز 72 ساعتانکوباسیوندر 37درجهموردآزمایشقرارگرفت. 76
شکل 3-22 طیفمربوطبهMSDفیبریلهایآمیلوئیدبتا (غلظتنهاییμM 50) کهبهمدت 20 دقیقهبااریتروپویتیناسیدی (غلظتنهایی μM 6) روییخانکوبهشدهوبهمدت 72 ساعتدر 37 درجهقرارگرفتهاست. 76
شکل 3-23 طیفمربوطبهMSDفیبریلهایآمیلوئیدبتا (غلظتنهاییμM 50) کهبهمدت 20 دقیقهبااریتروپویتیندایمر (غلظتنهایی μM 6) روییخانکوبهشدهوبهمدت 72 ساعتدر 37 درجهقرارگرفتهاست. 77
هفت |
فهرست جداول
جدول 2-1 انواعروشهايکروماتوگرافيبراساسويژگيهايمواد. 33
جدول 2-2-مقادیراستانداردسرمآلبومینگاوی (BSA) برایآزمایشبرادفورد. 37
جدول 2-3 موادموردنیازبرایتهیهمحلولاستوکآکریلآمید. 39
جدول 2-4 موادموردنیازبرایتهیهstackinggelbuffer. 39
جدول 2-5 موادموردنیازبرایتهیهبافرنمونه. 39
جدول 2-6 موادموردنیازبرایتهیهبافرالکترود. 40
جدول 2-7 موادموردنیازبرایتهیهمحلولآمونیومپرسولفات.. 40
جدول 2-8: مقادیرموردنیازبراتهیهژلجداکنندهالکتروفورز: 42
هفت |
