Filenaab@gmail.com
filenaab.ir
%53تخفیف

بررسي كمي تغييرات متيلاسيون پروموتر ژن p15INK4b متعاقب بيان پروتئين NS1 پاروو ويروس B19 در سلولهاي پيش ساز اريتروئيدي

تعداد184صفحه در فایل word

پاروو ويروسB19 عامل بحرانهای آپلازی اریتروئیدی ، بيماري پنجم و سقط جنين در سه­ماهه اول بارداری می باشد. اخیرا شواهدی مبنی بر دخالت ویروس در بیماریهایی همچون آرتریت روماتوئید، میوکاردیت حاد و از کارافتادگی حاد کبد ارائه شده است. همچنین طیفی از مطالعات بالینی رابطه همبستگی بین عفونت حاد پاروو ویروسB19 در بیماران، با وقوع لوسمی حاد در آنان را نشان داده اند؛ ولی در سطح سلولی و ملکولی پژوهشی پیرامون بررسی این رابطه انجام نگرفته است. در این مطالعه به ارزیابی اثر ژن NS1 پاروو ویروسB19 بر تغییرات متیلاسیون پروموتر ژنP15INK4b که مهمترین ژن درگیر در انواع لوسمی های حاد می باشد، پرداخته شده است. به این منظور ژن NS1 در وکتور لنتی ویروسی LeGO-iG2 کلون شده و پس از تولید لنتی ویروس حامل، ژنNS1 به سلولهای پیش ساز اریتروئیدی حاصل تمایز سلولهای CD34+ منتقل گردید. پس از اطمینان از بیان ژنNS1 و پس از گذشت 72 ساعت؛ DNA، RNA و پروتئین از سلولهای گروه دریافت کننده ژنNS1  و کنترل استخراج گردید. آزمونMSP کمی جهت ارزیابی تغییرات متیلاسیون ژنp15INK4b و آزمون RT-PCR کمی به منظور سنجش بیان ژن p15INK4b، سایر ژنهای مهارکننده کینازهای وابسته به سیکلین و ژنهای p53 و Rb انجام گرفت. همچنین وضعیت سیکل سلولی مورد آنالیز قرار گرفته و برای بررسی آپوپتوز از آزمونهای سنجش Annexin V و Caspase-3 استفاده گردید. نتایج حاصل از بررسی­ها نشان داد که ژنNS1 اثری بر متیلاسیون ژنp15INK4b و نیز سطح متیلاسیون کلی ژنوم ندارد و نیز تغییر معناداری در بیان ژنp15INK4b ایجاد نمی­نماید. بیان ژنهای CDKN1A، CDKN1B و CDKN1C به ترتیب 8/2، 2/4 و 9/18 برابر افزایش یافت و توقف سیکل سلولی در فاز G2 و آپوپتوز در سلولهای مورد آزمایش مشاهده گردید. بر پایه نتایج بدست آمده، NS1 یک القا کننده قوی آپوپتوز می باشد و مطالعات بعدی در این زمینه باید بر روی بررسی اثر سایر ژنهای پاروو ویروسB19 بر سلول میزبان ویروس معطوف شود.

كليد واژه: پاروو ویروسB19، متیلاسیونDNA، ژنp15INK4b، سلولهای پیش ساز اریتروئیدی، لوسمی

دسته: , برچسب: , , , ,

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                    صفحه

فصل1. مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته 1

1-1. پیشگفتار 2

1-2. پاروو ويروس B19 3

1-2-1. تاريخچه 3

1-2-2. تاکسونومي 4

1-2-3. تنوع ژنتيکي و اپيدميولوژي 5

1-2-4. ژنوم پاروو ويروسB19 6

1-2-4-1. ساختار ژنومي 6

1-2-4-2. تکثير ژنوم ويروس 9

1-2-4-3. نحوه تکثير ژنوم 10

1-2-4-4. عوامل سلولي مورد نياز ويروس جهت تکثير 10

1-2-4-5. فاکتورهاي ويروسي دخيل در تکثير 12

1-2-4-6. پروتئينهاي پاروو ويروس B19 12

1-2-4-6-1. پروتئينNS1 13

1-2-4-6-2. پروتئين VP 16

1-2-5. گرايش پاروو ويروس B19 16

1-2-6. تکثير ويروس و آپوپتوز سلولي 18

1-2-7. عفونت مداوم پاروو ويروس B19 19

1-2-8. تظاهرات باليني 19

1-3. اپی ژنتیک 20

1-3-1. متیلاسیون DNA 20

1-3-2. متیلاسیونDNA  و تنظیم رونویسی ژنها 23

1-3-3. متیلاسیون DNA و سرطان زایی 24

1-3-4. ویروسها و سرطان زایی 25

1-4. اهداف تحقیق 29

فصل2. مواد و روشها 33

2-1. مواد و وسايل 34

2-1-1. مواد 34

2-1-2. کیتهای مورد استفاده 36

2-1-3. وسايل آزمايشگاهي مورد نياز 37

2-2. روشها 39

2-2-1. روش تهیه بافرها و معرفها 39

2-2-1-1. روش تهيه بافر PBS 39

2-2-1-2. روش تهیه  بافر تریس-EDTA (TE) 39

2-2-1-3. روش تهیه بافر TAE 50X 40

2-2-1-4. بافر اتصال 40

2-2-1-5. روش تهیه بافرها و معرفهای مورد نیاز در وسترن بلات 41

2-2-1-6. روش تهیه گلیسرول 60% 42

2-2-1-7. طرز تهیه استوک آمپی سیلین 42

2-2-1-8. روش تهیه رنگ تریپان بلو 42

2-2-1-9. روش تهیه رنگ رایت-گیمسا 43

2-2-2. محیطهای کشت مورد استفاده 43

2-2-2-1. روش تهیه محیط کشت Alpha-MEM 43

2-2-2-2. روش تهیه محیط کشت LB مایع (LB broth) 44

2-2-2-3. روش تهیه محیط کشت LB جامد (LB  agar) 44

2-2-3. تهیه و آماده سازی فاکتورهای رشد 45

2-2-4. جداسازی سلولهای بنیادی CD34+ 45

2-2-4-1. جمع آوری خون بند ناف 45

2-2-4-2. جداسازی سلولهای تک هستهای خون بند ناف 45

2-2-4-3. جداسازی سلولهای CD34+ از سلولهای تک هسته ای 46

2-2-4-4. شمارش سلولهای CD34+ و تعیین درصد سلولهای زنده 47

2-2-5. تکثیر سلولهای CD34+ 47

2-2-6. تمایز سلولهای CD34+ به سلولهای پیش ساز اریتروئیدی 48

2-2-6-1. تایید تمایز سلولهای پیش ساز اریتروئیدی 49

2-2-6-1-1. فلوسیتومتری CD36 49

2-2-6-1-2. رنگ آمیزی رایت-گیمسا 49

2-2-7. اقدامات بیو انفورماتیک 49

2-2-8. کلونینگ ژن NS1 51

2-2-8-1. ویژگیهای وکتور لنتی ویروسی 51

2-2-8-2.  PCR ژن    NS1 51

2-2-8-3. تخلیص محصول PCR 53

2-2-8-4. هضم آنزیمی محصول PCR تخلیص شده ووکتورلنتی ویروسی 53

2-2-8-5. تخلیص از ژل 53

2-2-8-6. کلون کردن محصول PCR ژن NS1 در وکتور لنتی ویروسی 54

2-2-8-7. تهیه باکتریهای مستعد و الکتروپوریشن 54

2-2-8-8. غربالگری ژن کلون شده با استفاده از Colony PCR و هضم آنزیمی 56

2-2-8-9. تعیین توالی ژنهای کلون شده 57

2-2-9. تولید لنتی ویروس نوترکیب 57

2-2-10. تیتراسیون لنتی ویروس 58

2-2-11. آلوده سازی سلولهای پیش ساز اریتروئیدی با لنتی ویروس نوترکیب حاوی ژن NS1 59

2-2-12. استخراج پروتئین 60

2-2-13. وسترن بلات 60

2-2-14. استخراج DNA 61

2-2-15. استخراج RNA 62

2-2-15-1. ارزیابی کمی و کیفی  RNA استخراج شده 63

2-2-15-1-1. اندازه گيري غلظت RNA 63

2-2-15-1-2. بررسی کیفی RNA 63

2-2-16. سنتز cDNA 64

2-2-17. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) 64

2-2-17-1. مواد لازم براي انجام PCR 65

2-2-17-1-1. DNA  الگو 65

2-2-17-1-2. DNA پلي مراز (مقاوم به حرارت) 65

2-2-17-1-3. پرایمرها 66

2-2-17-1-4. بافر PCR 66

2-2-17-1-5. دزوکسی نوکلئوزید تری فسفات (dNTPs) 66

2-2-17-1-6. منیزیوم (MgCL2) 66

2-2-17-2. مراحل PCR 67

2-2-18.  Real-Time PCR 67

2-2-19. Real-Time Methylation Specific PCR 69

2-2-20. بررسی متیلاسیون کلی ژنوم 71

2-2-21. آزمایشهای بررسی آپوپتوز و سیکل سلولی 72

2-2-21-1. تست سنجش کاسپاز-3 فعال 72

2-2-21-2. آزمون PI/Annexin V 74

2-2-21-3. آنالیز سیکل سلولی 75

فصل3. نتایج و یافته­ها 76

3-1. کلونینگ ژن NS1 77

3-1-1. PCR ژن NS1 77

3-1-2. هضم آنزیمی 78

3-2. تایید کلونینگ 78

3-2-1. کلونیPCR 78

3-2-2. هضم آنزیمی 79

3-2-3. تعیین توالی ژن NS1 80

3-3. تولید لنتی ویروس نوترکیب 82

3-4. تولید سلولهای پیش ساز اریتروئیدی 83

3-5. انتقال ژنNS1 به سلولهای پیش ساز اریتروئیدی 85

3-5-1. تایید بیان ژن NS1 توسط فلوسیتومتری 85

3-5-2. تایید بیان ژن NS1 توسط Real-Time RT-PCR 87

3-5-3. تایید بیانNS1 توسط وسترن بلات 88

3-6. نتایج Real-Tiem MSP 89

3-7. نتایج سنجش متیلاسیون کلی ژنوم 91

3-8. نتایج Real-Time PCRژن p15INK4b  و سایر ژنهای سیکل سلولی 92

3-9. نتایج مربوط به بررسی آپوپتوز 94

3-9-1. نتیجه بررسی تکثیر سلولها و درصد سلولهای زنده 94

3-9-2. نتیجه آزمون سنجش کاسپاز-3 فعال 95

3-9-3. نتیجه آزمون Annexin V 96

3-10. نتایج مربوط به بررسی سیکل سلولی 98

فصل4. بحث، نتیجه­گیری و پیشنهادها 100

4-1. بحث و نتیجه گیری 101

4-2.پیشنهادات 114

فهرست منابع 116

ضمائم                                               128

چکیده انگلیسی                                       131

 فهرست جداول

عنوان                                                                                                                    صفحه

جدول ‏1‑1. تاکسونومي خانواده پاروو ويريده 4

جدول ‏1‑2.  لیستی از ژنها و نواحی ژنومی و تغییرات اپی ژنتیک آنها در سرطانهای مرتبط با انکو ویروسها 27

جدول‏2‑1. اپتیمایز کردن شرایط PCR با Pfu جهت تکثیر ژن NS1 52

جدول ‏3‑1. نتایج مربوط به سنجش متیلاسیون کلی ژنوم 92

جدول ‏3‑2. نتایج آزمون کاسپاز-3 95

فهرست نمودارها

 عنوان                                                                                                                    صفحه

نمودار ‏3‑1. الگوی تغییرات بیان ژنp15INK4b پس از انتقال ژن NS1 به سلولهای پیش ساز اریتروئیدی 93

نمودار ‏3‑2. الگوی تغییرات بیان ژنهای دخیل در سیکل سلولی متعاقب بیان ژن NS1 در سلولهای پیش ساز اریتروئیدی. 93

نمودار ‏3‑3. نمودار ستونی نتایج آزمون سنجش کاسپاز-3 فعال. 96

نمودار ‏3‑4. نمودار ستونی نتایج آزمون Annexin V . 98

فهرست شكل‌‌ها

عنوان                                                                                                                     صفحه

شکل ‏1‑1. تصوير شماتيک ناحیه ITR پاروو ويروسB19. 8

شکل ‏1‑2. تصوير شماتيک ژنوم پاروو ويروس B19 و سنتز mRNA هاي ويروسي. 8

شکل ‏1‑3. متیلاسیون در CpG. 22

شکل ‏1‑4. مکانیسمهای مختلف ویروسها جهت ایجاد سرطان در سلول میزبان از طریق تغییرات متیلاسیون. 28

شکل‏3‑1. نتیجه تیتراسیون Mgso4، pfu و دما جهت تکثیر ژنNS1 . 77

شکل ‏3‑2. تصویر ژل اگارز الکتروفورز ژن NS1 و وکتور هضم شده با BamHI. 78

شکل ‏3‑3. ژل الکتروفورز محصولات Colony PCR ژنNS1. 79

شکل ‏3‑4. هضم آنزیمی BamHI کلونی های مثبت از لحاظ Colony PCR. 80

شکل ‏3‑6. نتیجه تعیین توالی ژنNS1کلون شده در وکتور لنتی ویروسی. 81

شکل ‏3‑5. نتیجه blast توالی سکانس شده در NCBI. 81

شکل ‏3‑7. نقشه وکتور لنتی ویروسی نوترکیب حاوی ژن NS1 82

شکل ‏3‑8. تصویری از سلولهای 293T ترانسفکت شده با وکتور لنتی ویروسی حاوی گزارشگر eGFP و وکتورهای کمکی پس از 24 ساعت. 83

شکل ‏3‑9. نتیجه فلوسیتومتری سلولهای + CD34 جداسازی شده از خون بند ناف. 84

شکل ‏3‑10. تمایز سلولهای بنیادی CD34+ به سلولهای پیش ساز اریتروئیدی CD36+. 84

شکل ‏3‑11. نتایج فلوسیتومتری و تصویربرداری فلورسنت سلولهای CD36+ آلوده شده با لنتی ویروس نوترکیب پس از 72 ساعت. 86

شکل‏3‑12. آنالیز RT-PCR کمی ژنNS1 در گروههای آزمایش و کنترل. 87

شکل ‏3‑13. نتیجه وسترن بلات سلولهای پیش ساز اریتروئیدی آلوده شده با لنتی ویروس نوترکیب حاوی ژنNS1 و Mock به عنوان کنترل. 88

شکل ‏3‑14. تصویر ژل آگارز محصولات ژنهای COL2A1 (80bp) و p15 wild-type (137bp) بر روی نمونه های تیمار شده و تیمار نشده با بیسولفیت 90

شکل ‏3‑15. تصویر ژل آگارز محصولات ژنهای p15-M (80bp) و p15-U  (137bp) و کنترل داخلی COL2A1 بر روی نمونه DNA تیمار شده رده سلولی KG-1 90

شکل ‏3‑16. نتیجه Real-Time MSP. 91

شکل‏3‑17. کینتیک رشد و بقای سلولهای اریتروئیدی پس از انتقال ژن NS1. 94

شکل ‏3‑18. نتایج فلوسیتومتری Annexin V و PI سلولهای گروه آزمایش و کنترل. 97

شکل‏3‑19. نمودار فلوسیتومتری مربوط به نتایج آزمون بررسی سیکل سلولی. 99

لینکدین واتساپ

محصولات مرتبط

سایت بزرگ فایل ناب%34تخفیف

بررسی اثرات ژنهای rolC و trolC در گیاه ترا ژن توتون بر متابوليسم ثانويه

قیمت اصلی 35,000 تومان بود.قیمت فعلی 23,000 تومان است.
1.00
0 فروش
افزودن به سبد خرید
%34تخفیف

بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک ناشی از تجویز عصاره آبی منتا اسپیکاتا در پانکراس رت¬های دیابتی شده با آلوکسان

قیمت اصلی 32,000 تومان بود.قیمت فعلی 21,000 تومان است.
2.00
0 فروش
افزودن به سبد خرید
%41تخفیف

دانلود پروژه:رابطه بین سبک رهبری مدیران با عملکرد کارکنان پرستاری در بیمارستانهای آموزشی دانشگاه علوم پزشکی ایلام1393

قیمت اصلی 39,000 تومان بود.قیمت فعلی 23,000 تومان است.
3.67
0 فروش
افزودن به سبد خرید
امتیاز 0 از 5 از 0 دیدگاه

قیمت اصلی 45,000 تومان بود.قیمت فعلی 21,000 تومان است.

  • تاریخ ایجاد آذر 8, 1399
  • تاریخ بروزرسانی اسفند 13, 1401
  • فروش 0
  • دیدگاه 0
شرایط استفاده از محصول

تمام محصولات به ازای پرداخت پروژه تنها قابل استفاده می باشند. این بدین معنی است که برای استفاده از یک یا چند محصول ، لازم به خرید آن محصول است.

مزایای خرید این محصول:
  • دسترسی به فایل به صورت همیشگی
  • پشتیبانی رایگان
  • پشتیبانی 24 ساعته محصول
  • بازگشت وجه در صورت عدم رضایت مشتری
مشاهده قوانین سایت
قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
ثبت نام کنید
enemad-logo