انتقال ژن رمزکننده بتاگلوکورونیداز به گندم دوروم به واسطه آگروباکتریوم

       فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                      صفحه

 فصل اول: مقدمه. 1

1-1- گندم. 2

1-1-1- جایگاه و اهمیت گندم دوروم. 2

1-1-2- تولید جهانی گندم دوروم. 3

1-1-3- ویژگی­های گیاهشناسی گندم دوروم. 4

1-1-4- تفاوت­های گندم دوروم و گندم نان.. 5

1-2- انتقال ژن.. 6

1-2-1- انتقال مستقیم.. 7

1-2-1-1- روش­های فیزیکی انتقال ژن.. 7

1-2-1-1-1- انتقال ژن به روش بمباران ذره­ای.. 8

1-2-1-1-2- ریز تزریقی.. 8

1-2-1-1-3- الکتروپوریشن.. 9

1-2-1-1-4-  انتقال ژن از طریق لیپوزوم. 10

1-2-1-1-5-  استفاده از رشته­های سیلیکونی کاربیدی.. 10

1-2-1-1-6-  انتقال ژن از طریق امواج مافوق صوت… 10

1-2-1-1-7-  انتقال به واسطه ریزپرتوهای لیزری.. 11

1-2-1-1-8- بزرگ تزریقی.. 11

1-2-1-2- روش­های شیمیایی انتقال ژن.. 12

1-2-2- انتقال غیر مستقیم.. 12

1-2-2-1- انتقال به واسطه­ی ویروس­ها 12

1-2-2-2- انتقال ژن به واسطه­ی آگروباکتریوم. 13

1-2-2-2-1- پلاسمید Ti 15

1-2-2-2-2-  T-DNA.. 16

1-2-2-2-3- ژن­های بیماریزا 16

1-2-2-2-4- ژن­های کرووزومی.. 17

1-2-2-2-5- انتقال و ادغام T-DNA.. 17

1-2-3- انتقال ژن به روش غیر مبتنی بر کشت بافت (انتقال ژن در سطح گیاه) 19

1-2-3-1- انتقال ژن با دانه گرده 19

1-2-3-2-  انتقال ژن به واسطه لوله­ی گرده 20

1-3-2-3- انتقال ژن به واسطه قطع تخمدان.. 20

1-2-3-4- استفاده از سیستم نفوذ خلاء در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم  21

1-2-3-5- تلقیح بذرهای تازه جوانه زده با آگروباکتریوم. 22

1-2-3-6- غوطه­وری گل­آذین.. 22

1-2-3-7- تلقیح گل­آذین با محلول آگروباکتریوم. 23

1-3- ژن­های گزارشگر. 23

1-3-1- ژن گزارشگر gus 23

1-4- اهداف پژوهش…. 25

فصل دوم: مروری بر پژوهش­های پیشین… 26

2-1- انتقال ژن در گیاهان.. 27

2-1-1- انتقال ژن به گندم. 28

2-1-2- انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم در گیاهان تک لپه. 28

2-1-2-1- نژادهای پرکاربرد آگروباکتریوم در انتقال ژن به گندم. 30

2-1-3- انتقال ژن به روش غیر مبتنی بر کشت بافت… 31

2-1-3- 1- انتقال ژن به روش غیر مبتنی بر کشت بافت در گندم. 32

2-1-4- پیشبرهای پرکاربرد در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم در گندم  33

2-1-4-1- پیشبر CaMV35S. 34

2-1-5- ژن­های گزارشگر پرکاربرد در گندم. 35

2-1-5-1- ژن گزارشگر gus 35

2-1-6- نشانگرهای انتخابگر پرکاربرد در گندم. 36

 فصل سوم: مواد و روش­ها 37

3-1-کاشت گندم دوروم. 38

3-1-1- شرایط نگهداری.. 39

3-2- تهیه باکتری.. 39

3-2-1- تهیه باکتری حاوی ژن گزارشگر gus 39

3-2-1-1- ساخت محیط کشت LB جامد و مایع.. 40

3-2-1-1-1- تهیه محلول ذخیره آنتی­بیوتیک­ها 41

3-2-1-2- کشت باکتری.. 42

3-2-1-2-1- کشت باکتری E.coli حاوی پلاسمید pBI121 در محیط کشت

                  مایع.. 42

3-2-1-2-2- کشت باکتری آگروباکتریوم فاقد پلاسمید در محیط کشت مایع  42

3-2-1-2-3- کشت باکتری در محیط کشت LB جامد. 42

3-2-1-3- استخراج پلاسمید به روش لیز قلیایی.. 43

3-2-1-4- تهیه سلولهای باکتریایی مستعد برای انتقال ژن به روش شک حرارتی  45

3-2-1-4-1- تهیه محلول (M 1/0) CaCl₂  و (M 1/0) CaCl₂– گلیسرول

                                 (15%) 46

3-2-1-4-2- تهیه باکتری مستعد. 46

3-2-1-5- انتقال پلاسمید حاوی ژن gus به باکتری به روش شوک حرارتی  47

3-2-1-6- تهیه باکتری برای انتقال به گیاه 47

3-2-1-7- هضم دوگانه. 48

3-3- تهیه ژل آگاروز 1% و انجام الکتروفورز 48

3-3-1- تهیه بافر TBE.. 49

3-4- تهیه استوک باکتری.. 49

3-5- انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم. 49

3-5-1- انتخاب زمان انتقال به گیاه 49

3-5-2- انتقال باکتری.. 50

3-6- برداشت… 50

3-7- کشت بذرهای برداشت شده 51

3-7-1- شکستن خواب بذر با استفاده از اسید سولفوریک…. 52

3-7-2- ضد عفونی کردن بذرها 52

3-7-3- کشت بذرهای جوانه زده 52

3-8- استخراج دی‌ان‌ا به روش CTAB.. 52

3-8-1- پودر کردن نمونه‌ها 53

3-8-2- تهیه بافر استخراج دی­ان­ا 53

3-8-3- مراحل اصلی استخراج دی‌ان‌ 53

3-9- خالص سازی دی­ان­ا 55

3-10- واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 56

3-11- رنگ­آمیزی هیستوشیمایی.. 58

3-11-1- تهیه محلول رنگ آمیزی.. 59

فصل چهارم: نتایج و بحث…. 61

4-1- برداشت بذرهای تراریخته احتمالی.. 62

4-2- بررسی کیفیت دی­ان­ا استخراج شده 63

4-3- بررسی کیفیت پلاسمید استخراج شده 63

4-4- بررسی انتقال پلاسمید حاوی ژن gus به آگروباکتریوم به روش شوک حرارتی  64

4-5- آزمون هیستوشیمایی ژن gus 66

4-6- واکنش زنجیره­ای پلیمراز با آغازگرهای ژن رمزکننده اکتین.. 67

4-7- واکنش زنجیره­ای پلیمراز با آغازگرهای ژن gus 68

4-8- بررسی نسل دوم (T₁) 70

4-8-1- واکنش زنجیره­ای پلیمراز با آغازگرهای ژن رمزکننده اکتین برای نسل دوم  70

4-8-2- واکنش زنجیره­ای پلیمراز با آغازگرهای ژن gus برای نسل دوم. 71

4-9- بحث و نتیجه­گیری.. 73

4-10- پیشنهادات… 78

منابع.. 79

چکیده و عنوان به انگلیسی

فهرست جداول

عنوان                                                                                                     صفحه

جدول3-1- مواد تشکیل دهنده محیط کشت LB.. 40

جدول 3-2- مقدار و غظت نهایی آنتی­بیوتیک­ها در محیط کشت LB.. 41

جدول 3-3- تهیه محلول شماره 1. 44

جدول 3-4- مواد تشکیل دهنده محلول شماره 2. 44

جدول 3-5- تهیه محلول شماره 3. 45

جدول 3-6- مواد مورد نیاز وترتیب افزودن آنها برای هضم دوگانه. 48

جدول 3-7- مواد تشکیل دهنده بافر  TBE(X5) 49

جدول 3-8- مواد لازم جهت ساخت محلول بافر استخراج دی­ان­ا 54

جدول 3-9- نوع و مقدار مواد مورد استفاده در واکنش زنجیره‌ای پی‌سی‌آر 57

جدول 3-10- چرخه حرارتی واکنش پی‌سی‌آر برای تکثیر ژن  gus 57

جدول 3-11- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده به منظور بررسی بیان ژن گزارشگر

 gus                    57

جدول 3-12- چرخه حرارتی واکنش پی‌سی‌آر برای تکثیر ژن رمزکننده اکتین. 58

جدول 3-13- اسامی و توالی آغازگرهای مورد استفاده به منظور بررسی ژن رمز­کننده

                  اکتین. 58

جدول 3-14- تهیه محلول رنگ آمیزی هیستوشیمیایی.. 60

جدول 4-1- تعداد بذرهای تزریق شده و برداشت شده از سه رقم گندم دوروم  62

فهرست شکل­ها

عنوان                                                                                                                   صفحه

شکل 1-1-2- تولید جهانی گندم دوروم (بر حسب ملیون تن) از سال 2004 تا 2014  4

شکل 1-2- ساختمان گل در گندم. 5

شکل 1-3- انتقال ژن به روش ریز تزریقی به هسته سلولی با استفاده از میکروپایپت­ها

               شیشه­ای حاوی دی­ان­ا 9

شکل 1-4- نقشه ژنتیکی پلاسمید Ti 15

شکل 1-5- انتقال T-DNA از آگروباکتریوم به سلول گیاهی از طریق کانال غشایی  18

شکل 1-6- A) انتقال ژن با دانه گرده B) انتقال ژن به واسطه لوله­ی گرده C) انتقال ژن

               به واسطه قطع تخمدان.. 21

شکل 1-7- تاثیر آنزیم بتاگلوکورونیداز بر سوبسترای بیرنگ X-gluc و تبدیل آن به یک

               ترکیب آبی رنگ…. 24

شکل 3-1- کشت گندم دوروم در گلخانه. 38

شکل 3-2- پلاسمید pBI121 حاوی ژن گزارشگر  gus 40

شکل 3-3- کشت باکتری در محیط کشت LB جامد و رشد باکتری به صورت تک کلنی. 43

شکل 3-4- نحوه تزریق باکتری به تخمدان و خوشه­ای که به آن باکتری تزریق شده

               است… 51

شکل3-5- بذرهای تراریخته برداشت شده 51

شکل 3-6- تشکیل سه فاز پس از اضافه کردن کلروفرم- ایزوآمیل الکل و انجام

               سانتریفیوژ 54

شکل 3-7- تشکیل 3 فاز پس از اضافه کردن فنول و انجام سانتریفیوژ 55

شکل 3-8- قرار دادن گیاهان در محلول رنگ آمیزی و رنگ بری آنها با اتانول 70%  59

شکل 4-1- بررسی کیفیت دی­ان­ای استخراج شده از گیاهان تراریخته گندم دوروم  63

شکل 4-2- استخراج پلاسمید pBI121 حاوی ژن gus 64

شکل 4-3- رشد باکتریهای تراریخته حاوی ژن گزارشگر gus در محیط کشت انتخابی

               حاوی آنتی­بیوتیک­های کانامایسین و ریفامپیسین. 65

شکل 4-4- رشد کلنی­های تراریخته احتمالی در محیط کشت مایع حاوی آنتی­بیوتیک­-

               های کانامایسین و ریفامپیسین. 66

شکل 4-5- استخراج پلاسمید pBI121 حاوی ژن gus از باکتری­های تراریخته

               آگروباکتریوم. 66

شکل 4-6- رنگ آمیزی هیستوشیمایی ژن gus. 67

شکل 4-7- تکثیر قطعه 361 جفت بازی از ژن رمز کننده اکتین.. 68

شکل 4-8- تکثیر یک قطعه 359 جفت بازی از ژن gus از ژنوم گیاهان تراریخته نسل T₀

              رقم تارو3. 69

شکل 4-9- تکثیر یک قطعه 359 جفت بازی از ژن gus از ژنوم گیاهان تراریخته نسل  T₀

               رقم بهرنگ…. 69

شکل 4-10- تکثیر یک قطعه 359 جفت بازی از ژن gus از ژنوم گیاهان تراریخته نسل

 T₀                            رقم یاواروس…. 70

4-11- تکثیر قطعه 361 جفت بازی ژن رمز کننده اکتین.. 71

شکل 4-12- تکثیر قطعه 359 جفت بازی ژن gus از ژنوم گیاهان تراریخته نسل T₁

                 بهرنگ…. 72

شکل 4-13- تکثیر قطعه 359 جفت بازی ژن gus از ژنوم گیاهان تراریخته نسل T₁

                 تارو3. 72

شکل 4-14- تکثیر قطعه 359 جفت بازی ژن gus از ژنوم گیاهان تراریخته نسل T₁

                   یاواروس