ارزیابی مقایسه ای اثر عصاره های گیاهی استاندارد تجاری آقطی سیاه، سرخارگل و داروی آمانتادین بر دفع ویروس آنفلوآنزای H9N2 در جوجه های گوشتی و میزان ويروس در مايع آلانتوئيك جنين ماكيان  

فهرست مطالب
عنوان صفحه

فصل اول: مقدمه و هدف 2

فصل دوم: کلیات
2-1- آنفلوانزا 5
2-1-1- تاریخچه همه گیری های آنفلوانزای خفیف پرندگان در اثر تحت تیپH9N2 5
2-1-2- اهمیت بیماری از نظر بهداشت عمومی 7
2-1-2-1- انتقال ژنوم کامل ویروس آنفلوانزای پرندگان 7
2-1-2-2- انتقال قطعات ژن ویروس آنفلوانزای پرندگان 9
2-1-2-3- انتقال ویروس H9 N2 به انسان 10
2-1-3- اهمیت اقتصادی بیماری 11
2-1-4- سبب شناسی بیماری 13
2-1-4-1- ریخت شناسی ویروس های آنفلوانزا 13
2-1-4-1-1- تفاوت های ساختاری ویروس های آنفلوانزای A، BوC 15
2-1-4-1-2- ویروس های آنفلوانزای 16
2-1-4-1-3- ساختار شیمیایی 17
2-1-4-1-4- ژنتیک 18
2-1-4-1-5- ژنوم ویروس 18
2-1-4-1-6- تفاوت های آنتی ژنی سویه ها (آنتی ژنیک دریفت و آنتی ژنیک شیفت ) 20
2-1-4-1-7- پروتئین های ویروس 21
2-1-4-2- تکثیر ویروس 25
عنوان صفحه

2-1-4-3- حساسیت ویروس به مواد شیمیایی و عوامل فیزیکی 26
2-1-4-3-1- شرایط آزمایشگاهی 27
2-1-4-3-2- شرایط مزرعه 28
2-1-4-4- ميزبان هاي ويروس آنفلوانزا 29
2-1-4-4-1- ميزبان هاي آزمايشگاهي 29
2-1-4-4-2- ميزبان هاي طبيعي 30
2-1-4-5- پاتوتیپ 32
2-1-4-6- بیماریزایی 34
2-1-4-6-1- گروه هاي کلينيکي در مزرعه 34
2-1-4-6-2- مراحل ایجاد عفونت 36
2-1-4-6-3- تاثير پروتئين هماگلوتنين بر بیماریزایی 37
2-1-4-6-4- مکانيسم پاتوبيولوژي سلولي 39
2-1-5- پاتولوژی 40
2-1-5-1- دوره کمون 40
2-1-5-2- نشانه هاي باليني بيماري 41
2-1-5-3- علائم کالبد گشایی 44
2-1-5-4- جراحات ریز بینی 45
2-1-5-5- ایمنی 46
2-1-5-5-1- ایمنی زایی 46
2-1-5-5-2- ایمنی فعال 47
2-1-5-5-3-ایمنی غیر فعال 48
2-1-6- تشخیص 48
2-1-6-1- جمع آوری و نگهداری نمونه ها 49
2-1-6-1-1- جمع آوری نمونه های سواب 50
عنوان صفحه

2-1-6-1-2- جمع آوری نمونه های بافتی 51
2-1-6-1-3- جمع آوری سرم 51
2-1-6-2- جداسازی و تشخیص ویروس آنفلوانزا 52
2-1-6-3- سرولوژی 54
2-1-6-4- تشخیص تفریقی 55
2-1-6-5- تشخیص مستقیم پروتئین ها یا اسید های نوکلئیک ویروس آنفلوانزا 56
2-1-5-5-1- تشخیص مولکولی ویروس آنفلوانزای پرندگان 57
2-1-6-5-1-1- واکنش زنجیره ای پلی مراز ( ) 57
2-1-6-5-1-2- واکنش زنجیره ای پلی مراز زمان حقیقی 59
2-1-6- درمان 67
2-1-7-1- اکیناسه پورپورآ (ECHINACEA PUPUREA) 70
2-1-7-1-1- گیاه شناسی 70
2-1-7-1-2- کاربرد های سنتی 71
2-1-7-1-3-اثر ضد ويروسي 72
2-1-7-1-4- اثر Echinacea puprurea (EP) بر Cythokines و Chemokines در سلول های عفونی شده با ویروس 75
2-1-7-1-5- ترشح موسین 76
2-1-7-1-6- اثر ضد باکتری 77
2-1-7-1-7- اثر ضد قارچی 77
2-1-7-1-8- خواص آنتی اکسیدان 78
2-1-7-1-9- اثر EP بر عملکرد سلول های سیستم ایمنی 78
2-1-7-1-10- مطالعه اثر اکیناسه در موش 79
2-1-7-1-11- موارد کاربرد اکیناسه در دامپزشکی 80
2-1-7-1-12- استاندارد سازی 81
2-1-7-1-2-سامباکوس نیگرا (Sambucus nigra) 82
2-1-7-1-2-1-گیاه شناسی 82
عنوان صفحه

2-1-7-21-2-2-کاربردهای سنتی 84
2-1-7-1-2-2-3-پژوهش های جدید 85

فصل سوم: مواد و روش کار
3-1- مواد و وسايل مورد نياز 90
3-1-1-عصاره ها و دارو 90
3-1-1-1- عصاره گیاهی تجاری سرخارگل (Echinaforce®) 90
3-1-1-2- عصاره گیاهی تجاری آقطی سیاه(Original Sambucol ®) 90
3-1-1-3- پودر آمانتادین هیدروکلراید (Amantadine HCL) 91
3-1-2- ويروس 91
3-1-3- ساير مواد و وسايل مورد نياز 91
3-2- روش کار 92
3-2-1- بخش اول(آزمايش in vitro) 92
3-2-1-1- تعیین حداقل دز احتمالی توکسیک دارو برای جنین 93
3-2-1-2- تعیین (NI) Neutralization Index 93
3-2-1-3- بررسي تاثير دارو بر كاهش تيتر ويروس در مايع آلانتوئيك تخم مرغ جنين دار به روش HA و Real-Time PCR 94
3-2-2- بخش دوم(آزمایش های in vivo) 95
3-2-3- مراحل آزمایشگاهی 98
3-2-3-1- آزمايش هماگلوتيناسيون (Hemagglutination(HA) Test) 98
3-2-3-2- آزمايش ممانعت ازهماگلوتيناسيون (Hemagglutination Inhibition(HI) Test) 98
3-2-3-3- تهيه گلبول قرمز ماكيان(cRBC) 98
3-2-3-4- استخراج RNA 99
3-2-3-5- سنتز Cdna 101
3-2-3-6- آزمون PCR زمان حقيقي 102
عنوان صفحه

3-2-3-6-1- تعيين موارد مثبت در نمونه ها 102
3-2-3-6-2- تعيين تعداد كپي هاي قطعه M ژنوم ويروس در نمونه ها مثبت 103
3-2-3-7- تهيه پلاسميد نوتركيب 106
3-2-3-8- محاسبه تعداد نسخه پلاسميد نوتركيب 106
3-2-3-9- نرمال سازي RNA نمونه هاي مورد آزمايش 107
3-2-3-10- تجزیه و تحلیل آماری 107

فصل چهارم: نتايج
4-1- نتايج بخش اول(آزمايش in vitro) 109
4-1-1- تعیین حداقل دز توکسیک دارو برای جنین 109
4-1-2- تعیین (NI) Neuralization Index 110
4-1-3- بررسي تاثير دارو بر كاهش تيتر ويروس در مايع آلانتوئيك تخم مرغ جنين دار 110
4-2- نتايج بخش دوم (آزمايش in vivo) 112
4-2-1- نتايج آزمايش سرمي HI 112
4-2-2- نتايج مربوط به ارزيابي مولكولي تيتر ويروس آنفلوآنزا 113
4-2-2-1- نمونه ها مدفوعي 114
4-2-2-2- نمونه هاي ناي 116

فصل پنجم: بحث
5-1- بخش اول(آزمايش in vitro) 118
5-2- بخش دوم(آزمايش in vivo) 122
5-3- نتیجه گیری 126
5-4- پیشنهادات 127

فهرست منابع 128

فهرست جدول‌ها

عنوان صفحه

جدول 1: موارد تایید شده عفونت آنفلوانزای پرندگان در انسان 9
جدول 2 – مواردی از خسارت های ناشی از اپیدمی های HPAI و LPAI بر مبنای دلار آمریکا 12
جدول 3: طبقه بندي گياه اکیناسه پورپورآ 70
جدول4: کاربرد های درمانی عصاره سرخارگل در طب سنتی 72
جدول5: میزان اثر ضد ویروسی عصاره آبی و عصاره اتانولی اکیناسه پورپورآ بر ویروس های آزمایش شده در غلظت غیر سمی برای محیط کشت سلولی 73
جدول 6- ميزان اثر آنتي باكتريال گزارش شده عصاره اكيناسه پورپورآ بر باكتري هاي مختلف 77
جدول 7 – طبقه بندي گياه Sambucus nigra Black Elderberry ، آقطی سیاه ، انگور کولی یا خمان کبیر 82
جدول 8: خلاصه روش تعيين Neutralization Index 94
جدول9: خلاصه کار بررسي تاثير عصاره ها و دارو بر تيتر ويروس در مايع آلانتوئيك تخم مرغ جنين دار ماكيان به روش HA و Real-Time PCR 95
جدول 10 : نحوه مصرف عصاره/ دارو در گروه هاي مختلف 97
جدول 11: رديف آغازگرها (Primers) و پراب(Prob) مورد استفاده در سنتز cDNA و آزمون PCR زمان حقيقي 102
جدول 12: فرمول تهيه Master Mix براي نمونه هاي مايع آلانتوئيك در آزمايش in vitro 104
جدول 13: فرمول تهيه مخلوط نهايي واكنش PCR زمان حقيقي براي نمونه هاي مايع آلانتوئيك در آزمايش in vitro 104
جدول 14: فرمول تهيه مخلوط نهايي واكنش PCR زمان حقيقي براي پلاسميد نوتركيب (استاندارد) در آزمايش in vitro 105
عنوان صفحه

جدول 15: فرمول تهيه مخلوط نهايي واكنش PCR زمان حقيقي براي نمونه هاي بافتي(ناي و مدفوع) در آزمايش in vivo 105
جدول 16: فرمول تهيه مخلوط نهايي واكنش PCR زمان حقيقي براي پلاسميد نوتركيب (استاندارد) در آزمايش in vivo 105
جدول 17: نتایج تعیین حداکثر دز غیر سمی عصاره ها و دارو در مایع آلانتوئیک تخم مرغ‌های جنین دار 7 روزه 109
جدول 18 – نتایج محاسبه EID50 و (NI) Neuralization Index در بخش دوم آزمایش in vitro به منظور ارزیابی توانایی عصاره ها/دارو در مهار ویروس آنفلوانزا H9 110
جدول19- نتایج آزمون های هماگلوتیناسیون (HA) و qRT-PCR بر روی نمونه های مایع آلانتوئیک اخذ شده از تخم مرغ های جنین دار تلقیح شده با مخلوط 500 EID50 ویروس آنفلوانزای پرندگان H9N2 و سریال رقت 2fold از Echinaforce® یا Sambucol® 111
جدول 20- نتایج تیتر متوسط آزمایش HI نمونه های سرم اخذ شده از گروه های مختلف درمان و کنترل در روزهای پس از چالش با ویروس آنفلوانزای پرندگان H9N2 113
جدول21: نتايج آزمون PCR زمان حقيقي نمونه هاي مدفوع اخذ شده در روزهاي 3 تا 12 پس از چالش با ويروس آنفلوآنزا در گروه هاي مختلف 115
جدول 22- نتايج آزمون PCR زمان حقيقي نمونه هاي نای اخذ شده در روزهاي 3 تا 12 پس از چالش با ويروس آنفلوآنزا در گروه هاي مختلف 116

فهرست تصویرها
عنوان صفحه

تصویر 1- طرح شماتیک ویروس آنفلوانزا 14
تصویر 2- تفاوت های ساختاری ویروس های آنفلوانزای A وB وC 16
تصویر 3- مراحل تکثیر ویروس آنفلوانزا در سلول میزبان 26
تصویر 4- فعالیت اگزونوکلئازیDNA پلی مراز 62
تصویر5- چرخه آستانه و خط آستانه 64
تصوير 6: اکیناسه پورپورآ 70
تصوير 7 – درختچهSambucus nigra با گل های سفید 83
تصوير 8 – گل و شکوفه های سفید Sambucus nigra 83
تصوير 9 – خوشه میوه های رسیده سیاه رنگSambucus nigra 83

فهرست نمودار

عنوان صفحه

نمودار 1 – نتایج آزمون های هماگلوتیناسیون qRT-PCR بر روی نمونه های مایع آلانتوئیک اخذ شده از تخم مرغ های جنین دار تلقیح شده با مخلوط 500 EID50 ویروس آنفلوانزای پرندگان H9N2 با سریال رقت 2fold از Echinaforce® یا Sambucol 112