ارزیابی تأثیرات ضد میکروبی عصاره‌های آبی و الکلی آلوئه ورا روی میکروارگانیسم‌های شاخص پاتوژن (استافیلوکوکوس اورئوس ، اشرشیاکلی، لیستریا مونوسیتوژنز)

فهرست مطالب

 عنوان                                                                                                                          صفحه                           

فصل اول : کلیات

• معرفی …………………………………………………………………………………………………………. 2

• گیاه‌شناسی آلوئه ورا ………………………………………………………………………………………… 2

  • جنس آلوئه و گونه‌های آن …………………………………………………………………………….. 3

  • نیازهای اکولوژیکی و پراکنش جغرافیایی ………………………………………………………….. 3

• ترکیبات شیمیایی آلوئه ورا ………………………………………………………………………………… 4

  • برگ و محتویات آن ……………………………………………………………………………………. 5

    • مواد مؤثره برگ آلوئه ورا…………………………………………………………………………… 6

  • ژل آلوئه ورا و محتویات آن ………………………………………………………………………….. 6

    • خواص درمانی ژل آلوئه ورا ……………………………………………………………………… 7

  • عصاره آلوئه ورا …………………………………………………………………………………………. 8

1-3-3-1- خواص و کاربردها ………………………………………………………………………………….. 8

1-3-4- آلوئس ……………………………………………………………………………………………………… 9

1-3-4-1- خواص و کاربردها ………………………………………………………………………………….. 9

1-4- مواد مؤثره گیاه ………………………………………………………………………………………………. 9

1-4-1- گلیکوزیدها ……………………………………………………………………………………………….. 9

1-4-2- ساپونین ها ………………………………………………………………………………………………… 10

1-4-3- تانن ها …………………………………………………………………………………………………….. 10

1-4-4- رزین‌ها …………………………………………………………………………………………………….. 10

1-4-5- آلکالوئیدها ………………………………………………………………………………………………… 11

1-4-6- موسیلاژ ……………………………………………………………………………………………………. 11

1-4-7- اسید سالیسیلیک …………………………………………………………………………………………. 11

1-5- استخراج مواد مؤثره ………………………………………………………………………………………… 11

1-6- روش‌های رایج استخراج ………………………………………………………………………………….. 13

1-6-1- تقطیر ………………………………………………………………………………………………………. 13

1-6-2- تقطیر با آب ………………………………………………………………………………………………. 13

1-6-3- تقطیر با آب و بخار …………………………………………………………………………………….. 13

1-6-4- تقطیر با بخار(تقطیر با بخار مستقیم) ………………………………………………………………… 14

1-6-5- استخراج با روش فشردن سرد ……………………………………………………………………….. 14

1-6-6- استخراج با حلال‌ها ……………………………………………………………………………………… 14

1-6-7- استخراج با حلال‌های آلی …………………………………………………………………………….. 16

1-6-8- استخراج با سیال گرم یا داغ (روش خیساندن) …………………………………………………… 17

1-6-9- استخراج توسط حلال با بهره‌گیری از امواج مافوق صوت ……………………………………… 17

1-7- روش‌های نوین استخراج مواد مؤثره ……………………………………………………………………. 17

1-7-1- استخراج با استفاده از سیال فوق بحرانی …………………………………………………………… 17

1-7-2- استخراج با دی‌اکسید کربن فوق بحرانی …………………………………………………………… 18

1-8- روش استخراج عصاره آبی و الکلی آلوئه ورا ………………………………………………………… 20

1-9- pH و ظرفیت بافری ………………………………………………………………………………………. 20

1-10- عوامل ضد میکروبی ………………………………………………………………………………………. 22

1-11- نحوه عملکرد عوامل ضد میکروبی ……………………………………………………………………. 23

1-11-1- آسیب رساندن به DNA ……………………………………………………………………………. 23

1-11-2- تغییر ماهیت پروتئینی …………………………………………………………………………………. 24

1-11-3- از بین رفتن غشاء یا دیواره سلولی ………………………………………………………………… 24

1-12- میکروارگانیسم‌های مورد آزمون ………………………………………………………………………… 24

1-12-1- استافیلوکوکوس اورئوس …………………………………………………………………………….. 24

1-12-1-1- ارگانیسم و خصوصیات آن ………………………………………………………………………. 25

1-12-1-2- بیماری‌زایی و جنبه‌های کلینیکی ………………………………………………………………… 27

1-12-1-3- جداسازی و شناسایی ……………………………………………………………………………… 28

1-12-2- اشرشیاکلی ………………………………………………………………………………………………. 30

1-12-2-1- ارگانیسم و خصوصیات آن ………………………………………………………………………. 31

1-12-2-2- بیماری‌زایی و جنبه‌های کلینیکی ………………………………………………………………… 32

1-12-2-3- اشرشیاکلی مولد انتروتوکسین (ETEC) …………………………………………………….. 32

1-12-2-4- اشرشیاکلی حمله‌کننده به روده (EIEC) …………………………………………………….. 33

1-12-2-5- اشرشیاکلی انتروپاتوژنیک (EPEC) ………………………………………………………….. 34

1-12-2-6- اشرشیاکلی مولد خونریزی روده‌ای (EHEC) ……………………………………………… 34

1-12-2-7- جداسازی و شناسایی ……………………………………………………………………………… 34

1-12-3- لیستریا مونوسیتوژنز …………………………………………………………………………………… 35

1-12-3-1- ارگانیسم و خصوصیات آن ………………………………………………………………………. 36

1-12-3-2- بیماری‌زایی و جنبه‌های کلینیکی ………………………………………………………………… 37

1-12-3-3- جداسازی و شناسایی ……………………………………………………………………………… 38

1-13- اساس روش ……………………………………………………………………………………………….. 39

1-13-1- روش تعیین حساسیت باکتری با متد Micro Dilution  ………………………………….. 39

1-13-2- روش دیسک کاغذی …………………………………………………………………………………. 40

فصل دوم : بازنگری منابع

2-1- فعالیت ضد میکروبی آلوئه باربادنسیس میلر (آلوئه ورا) در شرایط آزمایشگاهی …………….. 44

2-2- بررسی اثر ضد میکروبی عصاره ژل آلوئه باربادنسیس میلر (آلوئه ورا) …………………………. 44

2-3- فعالیت ضد میکروبی عصاره خام آلوئه باربادنسیس بر روی پاتوژن های باکتریایی ………….. 44

2-4- فعالیت ضد میکروبی آلوئه ورا علیه میکروارگانیسم‌های پاتوژن ………………………………….. 45

2-5- مقایسه فعالیت ضد میکروبی ژل و برگ آلوئه ورا …………………………………………………… 45

2-6- فعالیت مهارکنندگی ژل آلوئه ورا در برخی باکتری‌های کاریوژنیک و پریودنتوپاتیک ………… 46

2-7- مقایسه فعالیت ضد میکروبی انواعی از ژل‌های آلوئه ورا در برابر میکروارگانیسم‌ها …………. 46

2-8- مطالعه تأثیر آلوئه ورا بر فعالیت ضد میکروبی ……………………………………………………….. 47

2-9- آنالیز ضد میکروبی و فیتوشیمیایی گیاه آلوئه ورا …………………………………………………….. 48

2-10- فعالیت ضد میکروبی ژل برگ آلوئه باربادنسیس میلر …………………………………………….. 50

2-11- بررسی اثر ایمونومدولاتوری عصاره گیاه آلوئه ورا و تأثیر آن بر کاندیدا آلبیکنس……………. 51

2-12- خواص ضد میکروبی عصاره آلوئه ورا بر رشد استافیلوکوکوس اورئوس …………………….. 51

2-13- بررسی اثر ضد میکروبی آلوئه ورا در برخی از پاتوژن های انسانی ……………………………. 52

2-14- مطالعه فعالیت ضد باکتریایی برگ،ریشه و ساقه آلوئه ورا در برخی ارگانیسم‌های انتخابی… 52

 

فصل سوم : مواد و روش

3-1- میکروارگانیسم‌های مورد آزمون ………………………………………………………………………….. 55

3-2- محیط‌های کشت و موارد مصرف ……………………………………………………………………….. 55

3-2-1- محیط کشت Mueller Hinton Agar ………………………………………………………… 55

3-2-2- محیط کشت Mueller Hinton Broth ………………………………………………………. 55

3-2-3- محیط کشت  Nutrient Agar…………………………………………………………………….. 55

3-3- دیسک‌های آنتی بیوگرام …………………………………………………………………………………… 56

3-3-1- آنتی بیوگرام (عملکرد ضد میکروبی) ……………………………………………………………….. 56

3-3-2- تست آنتی بیوگرام (تست حساسیت به آنتی‌بیوتیک) ……………………………………………. 56

3-3-3- اصول آنتی بیوگرام ………………………………………………………………………………………. 58

3-4- روش‌های مختلف انجام تست تعیین حساسیت دارویی …………………………………………… 58

3-5- وسایل و مواد موردنیاز برای تست آنتی بیوگرام (دیسک دیفیوژن) ……………………………… 58

3-6- روش نگهداری دیسک‌های کاغذی (آنتی‌بیوتیک) …………………………………………………… 58

3-7- آماده‌سازی عصاره آبی و الکلی آلوئه ورا ……………………………………………………………… 59

3-8- pH عصاره آبی و الکلی آلوئه ورا ……………………………………………………………………… 59

3-9- ماده خشک حاصل از عصاره آبی و الکلی آلوئه ورا ………………………………………………… 59

3-10- آماده‌سازی محلول استاندارد 5/0 مک فارلند ………………………………………………………… 60

3-11- آماده‌سازی سویه‌های میکروبی …………………………………………………………………………. 60

3-12- تعیین خاصیت ضد میکروبی عصاره آبی و الکلی آلوئه ورا ……………………………………… 61

3-12-1- نحوه تلقیح به صفحه Microdilution ………………………………………………………… 61

3-12-2- تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) به روش میکروبراث دایلوشن ………………… 61

3-12-3- تعیین جذب نوری میکروپلیت ها توسط دستگاه الایزاریدر ………………………………….. 63

3-12-4- تعیین حداقل غلظت کشندگی (MBC) به روش کشت سطحی …………………………… 63

3-13- تعیین استاندارد انتشار دیسک در آگار یا روش Agar Diffusion …………………………. 64

3-13-1- چگونگی تلقیح شیرابه میکروبی به محیط کشت جامد ………………………………………… 65

3-13-2- انتشار دیسک در آگار (دیسک دیفیوژن) ………………………………………………………… 66

فصل چهارم : نتایج و تجزیه تحلیل آماری

4-1- هدف اصلی پژوهش ……………………………………………………………………………………….. 69

4-2- تعیین خاصیت ضد میکروبی عصاره آبی و الکلی آلوئه ورا ……………………………………….. 69

4-2-1- تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) به روش میکروبراث دایلوشن ………………….. 69

4-2-2- اندازه‌گیری جذب نوری توسط دستگاه الایزاریدر ………………………………………………… 69

4-2-3- حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) ………………………………………………………………… 70

4-2-4- تجزیه تحلیل داده‌های دستگاه الایزاریدر …………………………………………………………… 71

4-2-5- تعیین حداقل غلظت کشندگی (MBC) به روش کشت سطحی …………………………….. 74

4-3- انتشار دیسک در آگار (دیسک دیفیوژن) ……………………………………………………………… 74

4-4- تست حساسیت به آنتی‌بیوتیک ………………………………………………………………………….. 76

 

فصل پنجم : بحث و نتیجه‌گیری

5-1- پوشش سلولی ……………………………………………………………………………………………….. 79

5-2- دیواره سلولی ………………………………………………………………………………………………… 79

5-2-1- اجزای ویژه دیواره سلولی گرم مثبت ……………………………………………………………….. 79

5-2-1-1- اسیدهای تیکوئیک و تیکورونیک …………………………………………………………………. 80

5-2-1-2- پلی ساکاریدها ……………………………………………………………………………………….. 80

5-2-2- اجزای ویژه دیواره سلولی گرم منفی ………………………………………………………………… 80

5-2-2-1- لیپوپروتئین ……………………………………………………………………………………………. 80

5-2-2-2- غشاء خارجی ………………………………………………………………………………………… 80

5-2-2-3- لیپوپلی ساکارید (LPS) …………………………………………………………………………… 81

5-2-2-4- فضای پری پلاسمیک ………………………………………………………………………………. 81

5-3- فعالیت ضد باکتریایی گیاه ………………………………………………………………………………… 81

5-4- نتیجه‌گیری کلی ……………………………………………………………………………………………… 82

منابع فارسی ………………………………………………………………………………………………………….. 83

منابع لاتین  …………………………………………………………………………………………………………… 84

فهرست جدول‌ها

 عنوان                                                                                                                          صفحه                           

جدول 1-1- معرفی آلوئه ورا ……………………………………………………………………………………. 2

جدول 1-2- مقدار دما و فشار بحرانی برای برخی از سیال‌های فوق بحرانی رایج ………………….. 18

جدول 1-3- فاکتورهای مؤثر بر رشد و تولید انتروتوکسین توسط استافیلوکوکوس اورئوس ………. 26

جدول 2-1- آنالیز فیتوشیمیایی نمونه‌های آلوئه ورا …………………………………………………………. 49

جدول 2-2- فعالیت ضد میکروبی ژل و برگ آلوئه ورا …………………………………………………… 50

جدول 2-3- فعالیت ضد میکروبی عصاره ژل آلوئه ورا ……………………………………………………. 52

جدول 2-4- اندازه‌گیری قطر هاله مهارکننده توسط عصاره برگ آلوئه ورا برحسب میلی‌متر……….. 53

جدول 2-5- اندازه‌گیری قطر هاله مهارکننده توسط عصاره ساقه آلوئه ورا برحسب میلی‌متر ………. 53

جدول 2-6- اندازه‌گیری قطر هاله مهارکننده توسط عصاره ریشه آلوئه ورا برحسب میلی‌متر ……… 53

جدول 3-1- طیف اثر و منبع بیولوژیک آنتی‌بیوتیک‌ها ……………………………………………………… 56

جدول 3-2- درصد ماده خشک عصاره آبی و الکلی آلوئه ورا …………………………………………… 60

جدول 4-1- داده‌های مربوط به جذب نوری میکروپلیت توسط الایزاریدر برحسب 625 نانومتر….. 70

جدول4-2- حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) عصاره آبی و اتانولی آلوئه ورا به روش میکرودایلوشن برحسب (mg/ml) ……………………………………………………………………………………………………………. 70

جدول4-3- میانگین قطر هاله مهارکننده، توسط عصاره آلوئه ورا به روش دیسک دیفیوژن برحسب

میلی‌متر ………………………………………………………………………………………………………………… 75

جدول4-4- میانگین قطر هاله مهارکننده، توسط آنتی‌بیوتیک به روش دیسک دیفیوژن برحسب

میلی‌متر ………………………………………………………………………………………………………………… 76

فهرست شکل‌ها

 عنوان                                                                                                                          صفحه                           

شکل 1-1- جداسازی ژل و محتویات برگ آلوئه ورا ………………………………………………………. 5

شکل 3-1- تست آنتی‌بیوتیک و مشاهده قطر هاله مهارکننده رشد و چگونگی اندازه‌گیری آن …….. 57

شکل 3-2- نحوه رقیق‌سازی عصاره آلوئه ورا در میکروپلیت 96 خانه‌ای ……………………………… 62

شکل 3-3- گرمخانه گذاری میکروپلیت ها …………………………………………………………………… 62

شکل 3-4- دستگاه الایزاریدر ……………………………………………………………………………………. 63

شکل 3-5- رشد میکروارگانیسم‌ها در پلیت حاوی محیط کشت مولر هینتون آگار ………………….. 63

شکل 3-6- دیسک‌های کاغذی آغشته به عصاره آلوئه ورا در محیط کشت (MHA) ……………… 67

شکل 4-1- عصاره آبی – لیستریا مونوسیتوژنز ………………………………………………………………. 71

شکل 4-2- عصاره آبی – استافیلوکوکوس اورئوس ………………………………………………………… 71

شکل 4-3- عصاره آبی – اشرشیاکلی ………………………………………………………………………….. 72

شکل 4-4- عصاره اتانولی – لیستریا مونوسیتوژنز …………………………………………………………… 72

شکل 4-5- عصاره اتانولی – استافیلوکوکوس اورئوس …………………………………………………….. 73

شکل 4-6- عصاره اتانولی – اشرشیاکلی ……………………………………………………………………… 73

شکل 4-7- قطر هاله مهارکننده، عصاره اتانولی آلوئه ورا روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ….. 75

شکل 4-8- قطر هاله مهارکننده، عصاره اتانولی آلوئه ورا روی باکتری لیستریا مونوسیتوژنر…………. 75

شکل 4-9- قطر هاله مهارکننده، آنتی‌بیوتیک اریترومایسین روی باکتری لیستریا مونوسیتوژنز ……… 76

شکل 4-10- قطر هاله مهارکننده، آنتی‌بیوتیک کلرامفنیکل روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس …. 76

شکل 4-11- قطر هاله مهارکننده، آنتی‌بیوتیک جنتامایسین روی باکتری اشرشیاکلی …………………. 77