اثر یون مس بر ساختار، فعالیت چاپرونی و ویژگی های آمیلوئیدیαA -کریستالین انسانی پراکسی نیتریته و بررسی اثر یون کلسیم بر توده ای شدن کریستالین های پراکسی نیتریته ی لنز چشم گاو.

 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                              صفحه

فصل اول: مقدمه

1-1- ساختار و نمو لنز چشم 1

1-1-2- لنز جنینی 1

1-1-3- کپسول و اپیتلیوم لنز 2

1-1-4- سلول های فیبری لنز چشم 3

1-1-5- مصرف انرژی و همئوستاز یونی لنز چشم 4

1-1-6- شفافیت لنز چشم 5

1-2- پروتئین های لنز چشم 6

1-2-1- آلفا-کریستالین 7

1-2-2- بتا-گاما کریستالین 10

1-2-3- بتا کریستالین 10

1-2-4- گاما کریستالین 10

1-3- برهمکنش کریستالین ها و تداخل بین آن ها 11

1-4- آب مروارید………………………………………………………………………………………………………………………12

1-4-1- انواع آب مروارید وابسته به سن 13

1-4-1-1- آب مروارید هسته ای 13

1-4-1-2- آب مروارید پوسته ای 13

1-5- فرآیند توده ای شدن پروتئین های لنز و نقش آن در تشکیل آب مروارید 14

1-6- فیبر آمیلوئید و ارتباط آن در تشکیل آب مروارید 16

1-7- انواع تغییرات شیمایی پروتئین های کریستالین و نقش آن ها در بیماری آب مروارید 17

1-7-1- قندی شدن غیر آنزیمی پروتئین آلفا-کریستالین 17

1-7-2- اکسایش پروتئین آلفا-کریستالین 18

1-7-3- دآمیناسیون، کوتاه شدگی و قطعه قطعه شدن پروتئین آلفا-کریستالین 19

1-7-4- هموسیستئینه شدن پروتئین آلفا-کریستالین 20

1-8- آنتی اکسیدان ها و پاک کننده های رادیکال آزاد لنز 20

1-9- جریان یونی لنز و نقش آن در همئوستاز یونی 22

1-9-1- سدیم و پتاسیم 23

1-9-2- کلر 24

1-9-3- روی 24

1-9-4- آهن 24

1-9-5- منیزیم 25

1-9-6- کلسیم 25

1-9-7- مس 27

1-9-8- سلنیم، سرب و کادمیم 28

1-10- 1- بیوشیمی پراکسی نیتریت به عنوان مولکول اکسایشگر طبیعی 29

1-10-2- پراکسی نیتریته شدن پروتئین ها  و آثار آن بر بدن 34

1-10-3- پراکسی نیتریت و بیماری های چشمی 40

1-11- پراکسی نیتریت و کلسیم 42

1-12-مس، اسید آسکوربیک و آب مروارید 44

فصل دوم: مروری بر پژوهش های پیشین

مروری بر پژوهش های پیشین………………………………………………………………..45

اهداف پژوهشی…………………………………………………………………………………51

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1-مواد مصرفی……………………………………………………………………………53

3-1-1- دستگاه ها……….…………………………………………………………………53

3-2- تهیه ی محلول ها …………….…………………………………………………….53

3-2-1-محلول برادفورد …….…………………………………….……………………….53

3-2-2-تهیه ی محلول های مورد نیاز روش الکتروفورز ژلی عمودی………………….55

3-2-2-1-تهیه ی محلول آکريل آميد و بيس آکريل آميد…………………………….55

3-2-2-2-تهیه ی محلول20 درصد SDS  ……………………………………….…….55

3-2-2-3-تهیه ی محلول 10 درصد آمونيوم پرسولفات………………………………..55

3-2-2-5-تهیه ی بافر تریس 5/0 مولار………………………………………………….56

3-2-2-4-تهیه ی محلول بافر تریس 5/1 مولار…………………………………………56

3-2-2-6-تهیه ی بافر تانک……………………………………………………………….56

3-2-2-7-تهیه ی بافر نمونه X2………………………………………………………….57

3-2-2-8-تهیه ی محلول رنگ‌آميزي کوماسي بلو………………………………………57

3-2-2-9-تهیه ی محلول رنگ بر کوماسي بلو…….…………………………………….58

3-2-3-تهیه ی محلول های مورد نیاز سنجش گروه کربونیل………………………….58

3-2-3-1-تهیه ی محلول 4،2- دی نیترو فنیل هیدرازین…………………………….58

3-2-3-2-تهیه ی محلول اسید تری کلرو استیک (TCA) 20 درصد…………………59

3-2-3-3-تهیه ی محلول اتانول-اسید اتیل استیک (نسبت 1:1 ، حجمی)………….59

3-2-3-4-تهیه ی محلول گوانیدین هیدروکلراید 6 مولار………………………………59

3-2-4-تهیه ی محلول استوک ANS ………………………………………………………………………….60

3-2-5-تهیه ی محلول استوک تیوفلاوین-…………………………………………….T60

3-2-6-تهیه ی محلول استوک اسید آسکوربیک………………………………………..61

3-2-7-تهیه ی محلول های پروتئینی و تعیین غلظت آن ها……..…………………….62

3-2-7-1-تهیه ی محلول انسولین…….………………………………………………….63

3-3- تهیه ی محیط های کشت باکتری………………………………………………. 64

3-3-1- تهیه ی محیط کشت جامد………………………………………………………64

3-3-2- تهیه ی محیط کشت مایع……………………………………………………….65

3-4- روش ها……………………………………………………………………………….65

3-4-1- آماده سازی پروتئین های لنز چشم گاو………………………………………..65

3-4-2- بیان زیر واحد هایαA  و αB-کریستالین انسانی در سلول های BL21 ……. 66

3-4-3- تخلیص زیر واحدهایαA  و αB-کریستالین انسانی……………………………67

3-4-4- تعیین میزان خلوص پروتئین به روش SDS-PAGE …………….…..……… 69

3-4-5-فرآیند سنتز پراکسی نیتریت………………………………………………………69

3-4-6- فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئین های محلول لنز چشم وαA  و αB-کریستالین انسانی….………………………………………………………………………..72

3-4-7-مطالعه ی هضم آنزیمی پروتئین های محلول لنز چشم طبیعی و تغییریافته با آنزیم آلفا-کیموتریپسین….…………………………………………………………………72

3-4-8-سنجش مقدار گروه های کربونیل پروتئین های محلول لنز چشم وαA  و αB-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته……………………………………………………73

3-4-9- مطالعه فرآیند توده ای شدن پروتئین های کریستالین طبیعی و تغییر یافته در حضور یون کلسیم……………………………………………………………………………74

3-4-10- مطالعه ی فلورسانس پروتئین های محلول لنز چشم و αA-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته…………………………………………………………………………74

3-4-10-1- مطالعه ی فلورسانس ذاتی………………………………………………….75

3-4-10-2- مطالعه ی فلورسانس عارضی ANS))……………………………………..76

3-4-10-3- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین-………………………………………..T77

3-4-11- الکتروفورز ژلی پروتئین های محلول لنز چشم طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور یون کلسیم…………………………………………………77

3-4-12- مطالعه ی اثر محافظتیαA -کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته  بر اکسایش اسید آسکوربیک در حضور یون مس……………………………………………79

3-4-13- مطالعه ی فعالیت چاپرونی αA-کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته در حضور یون مس…………….………….………………………………………………………80

فصل چهارم:  نتایج و بحث

بخش اول……………………………………………………………………………………………………………………82

4-1- مطالعه ی اثر پراکسی نیتریته شدن بر ساختار، ایجاد حالت الیگومری و توده ای شدن پروتئین های لنز چشم در حضور یون کلسیم…………………………………………………82

4-1-1-نقش پراکسی نیتریت و کلسیم در بیماری زایی عارضه ی آب مروارید……..83

4-1-2-مطالعه ی فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئین های محلول لنز……………..85

4-1-2-1-سنجش تغییر حرکت ژل الکتروفورز پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت……………………………………………………………………………………………………..85

4-1-2-2-سنجش مقدار کربونیل پروتئین های لنز تغییریافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………………………………………..87

4-1-2-3- مطالعه ی فلورسانس ANS پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..89

4-1-2-4-مطالعه ی فلورسانس دی تیروزین پروتئین های لنز تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..89

4-1-2-5-مطالعه ی اسپکتروسکوپی مرئی-فرابنفش پروتئین های کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………….90

4-1-3-مطالعه ی ناپایداری پروتئولیزی پروتئین های لنز  تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………………..90

4-1-4-مطالعه ی توده ای شدن پروتئین های طبیعی و تغییر یافته ی لنز به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور یون کلسیم………………………………………………………………….92

4-1-5-ارزیابی الیگومری شدن پروتئین های لنز طبیعی و تغییریافته در حضور یون کلسیم به وسیله ی الکتروفورز ژلی……………………………………………………………………………94

4-1-6-مطالعه ی فلورسانس عارضی پروتئین های طبیعی و تغییر یافته لنز در حضور یون کلسیم………………………………………………………………………………………………………………….99

4-1-7-مطالعه ی تشکیل فیبر آمیلوئیدی کریستالین های طبیعی و تغییر یافته در حضور یون کلسیم……………………………………………………………………………………………………101

بخش دوم…………………………………………………………………………………………………………………104

4-2- مطالعه ی ساختار و فعالیت چاپرونیαA -کریستالین های انسانی طبیعی و پراکسی نیتریته شده و بررسی نقش محافظتی آن ها در برابر اکسایش اسید آسکوربیک به وسیله ی یون های مس………………………………………………………………………………………104

4-2-1- بیان زیر واحد هایαA  و αB-کریستالین انسانی در سلول های BL21………………………………………………………………………………………………………………………105

4-2-2-تخلیص پروتئین هایαA  و αB-کریستالین انسانی…………………………………106

4-2-3- مطالعه ی فرآیند پراکسی نیتریته شدن پروتئینαA -کریستالین انسانی……………………………………………………………………………………………………………………….108

4-2-3-1- مطالعه ی الکتروفورز ژلی پروتئینαA -کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………………………..108

4-2-3-2-سنجش مقدار کربونیل پروتئین های αA و αB-کریستالین تغییریافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………..109

4-2-3-3- مطالعه ی فلورسانس تریپتوفان و عارضی پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………….110

4-2-3-4-مطالعه ی فلورسانس دی تیروزین پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………………………..111

4-2-3-5-مطالعه ی اسپکتروسکوپی مرئی-فرابنفش پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت………………………………………………………………………….111

4-2-3-6- مطالعه ی تشکیل فیبر آمیلوئیدی پروتئین αA-کریستالین تغییر یافته……………………………………….…………………………………………….112

4-2-4- مطالعه ی اثر محافظتیαA -کریستالین انسانی طبیعی و تغییر یافته  بر اکسایش اسید آسکوربیک در حضور یون مس………………………………………………………..114

4-2-5-مطالعه ی فعالیت چاپرونی پروتئینαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته………………………………………………………………………………………………………………………….116

4-2-6- مطالعه ی فعالیت چاپرونی پروتئینαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته در حضور یون مس………………………………………………………………………………………………………..117

نتیجه ی نهایی………………………………………………………………………………………………….119

فهرست منابع و مآخذ……………………………………………………………………………………..121

 

 

 

 

 

فهرست جداول

 

عنوان و شماره                                                                                  صفحه     

جدول3-1- مواد لازم جهت تعیین منحنی استاندارد محلول برادفورد…………………………………. 54

جدول3-2- مقادیر لازم از مواد مختلف مورد نیاز جهت تهیه 500 میلی لیتر بافرتانک………. 56

جدول3-3- مقادیر لازم از مواد مختلف مورد نیاز جهت تهیه 25 میلی لیتر بافرنمونه X2…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 57

جدول 3-4- مقادیر لازم از مواد مورد نیاز جهت تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت جامد…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 64

جدول 3-5- مقادیر لازم از مواد مورد نیاز جهت تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت مایع………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 65

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها

 

عنوان                                                                                                صفحه

شکل1-1- نمایی از ساختار لنز چشم و اهمیت پروتئین های کریستالین لنز در عملکرد آن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………6

شکل 1-2- نمایی از ساز و کار فعالیت چاپرونی………………………………………………………………………15

شکل 1-3- نمایی از ساختار لنز (A)، سیستم جریانی میکرو درونی (B) و نمای سیستم جریانی از مقطع عرضی ناحیه ی استوایی………………………………………………………………………………. 22

شکل 1-4- نمایی از مسیر فعال شدن کالپین به وسیله ی کلسیم در لنز……………………………. 27

شکل 1-5- نمایی از تولید پراکسی نیتریت به وسیله ی ماکروفاژ تحریک شده…………………….30

شکل 1-6- نمایی از بیوشیمی پراکسی نیتریت و اهداف آن…………………………………………………..33

شکل 1-7- نمایی از اثر فیزیولوژیک وپاتولوژیک پراکسی نیتریت بر مولکول های زیستی………………………………………………………………………………………………………………………………………..37

شکل 1-8- نقش سوپراکسید و پراکسی نیتریت در ساز و کار عملکرد بد قلب و عروق در دیابت………………………………………………………………………………………………………………………………………….40

شکل 3-1- منحنی استاندارد محلول برادفورد…………………………………………………………………………55

شکل3-2-نمایی از واکنش گروه کربونیل با 4،2- دی نیترو فنیل هیدرازین…………………………59

شکل 3-3-نمایی از طیف جذبی ترکیب فلور ANS ………………………………………………………………60

شکل 3-4- نمایی از طیف جذبی تیوفلاوین T- ……………………………………………………………………..61

شکل 3-5-ساختار اسید آسکوربیک…………………………………………………………………………………………62

شکل3-6-نمایی از طیف جذبی آلفا-کریستالین……………………………………………………………………. 63

شکل3-7-نمایی از طیف جذبی انسولین………………………………………………………………………………… 64

شکل 3-8- نمایی  از دستگاه جمع آوری نمونه ((Fraction collector………………………………. 68

 شکل 3-9- نمایی از دستگاه طراحی شده توسط Robinson و Beckman ………………………..70

شکل 3-10- نمایی از دستگاه سنتز پراکسی نیتریت در آزمایشگاه شیمی پروتئین  (PCL)بر اساس طرح Robinson و Beckman ………………………………………………………………………………………71

شکل 3-11-نمایی از طیف جذبی پراکسی نیتریت و پراکسید هیدروژن (منحنی داخلی) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..71

شکل 3-12- نمایی از دستگاه الکتروفورز ژلی ………………………………………………………………………..79

شکل 3-13- نمایی از مسیر اکسایش اسید آسکوربیک به وسیله ی یون مس………………………79 شکل 4-1-1- مسیر احتمالی برای نقش پراکسی نیتریت و کلسیم در ایجاد عارضه ی آب مروارید و نابینایی ……………………………………………………………………………………………………………………..84

شکل 4-1-2- نمایی از نمونه های TSPs پس از انکوبه …………………………………………………………86

شکل 4-1-3- مقایسه ی وضعیت الیگومری و ویژگی های ساختاری TSPs طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت …………………………………………………………………………………………..88

شکل 4-1-4- مطالعه ی هضم نمونه های TSPs طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت در حضور کیموتریپسین……………………………………………………………………………………………… 91

شکل 4-1-5- اثر کلسیم بر توده ای شدن  TSPs طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت……………………………………………………………………………………………………………………………………… 92

شکل 4-1-6- مطالعه ی سینتیکی القاء توده ای شدن TSPs  طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی یون کلسیم……………………………………………………………………………………………………………………………93

شکل 4-1-7- تغییر الگوی حرکت الکتروفورزی نمونه های TSPs انکوبه شده با کلسیم به مدت 24 ساعت……………………………………………………………………………………………………………………….. 95

شکل 4-1-8- تغییر حرکت الکتروفورزی نمونه های TSPs انکوبه شده با کلسیم به مدت 2 هفته…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 97

شکل 4-1-9- مطالعه ی SDS-PAGE نمونه های TSPs انکوبه شده با کلسیم برای مدت 24 ساعت و 2 هفته قبل و بعد از سانتریفیوژ……………………………………………………………………………….. 98

شکل 4-1-10- مطالعه ی فلورسانس ANS نمونه های مختلف TSPs…………………………….. 100

شکل 4-1-11- مطالعه ی فلورسانس تیوفلاوین-T نمونه های مختلف TSPs…………………. 102

شکل 4-1-12- نقش احتمالی توأم پراکسی نیتریت و کلسیم در ایجاد عارضه ی آب مروارید…………………………………………………………………………………………………………………………………… 103

شکل 4-2-1- نمایی از باکتری اشیریشیا کلی سویه  BL21(DE3)کشت داده شده در محیط کشت جامد (a) و مایع (b)…………………………………………………………………………………………………… 105

شکل 4-2-2- نمایی از ژل SDS-PAGE 12 درصد محلول های پروتئینی حاوی αA و αB-کریستالین القا شده به وسیله ی IPTG…………………………………………………………………………………106 شکل 4-2-3- نمایی از رسوب به دست آمده پس از سانتریفیوژ …………………………………………106 شکل 4-2-4- کروماتوگرام ستون تعویض آنیونی Q- سفاروز و فیلتراسیون ژلی سفاکریلS-300 پروتئین هایαA -کریستالین (a) و αB-کریستالین (b)………………………………………………107 شکل 4-2-5- نمایی از ژل SDS-PAGE 12 درصد نمونه های پروتئینیαA  و αB-کریستالین……………………………………………………………………………………………………………………………… 108 شکل 4-2-6- مطالعه ی حرکت الکتروفورزی پروتئینαA –کریستالین و تعیین محتوی کربونیل αA  و αB-کریستالین طبیعی و تغییر یافته…………………………………………………………. 110

شکل 4-2-7- مطالعه ی تغییر ویژگی های ساختاری αA-کریستالین طبیعی و تغییر یافته به وسیله ی پراکسی نیتریت…………………………………………………………………………………………………….. 113

شکل 4-2-8- مطالعه ی اثر محافظتیαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته  بر اکسایش اسید آسکوربیک القا شده به وسیله ی یون مس………………………………………………………………………….. 115

شکل 4-2-9- مطالعه فعالیت چاپرونی پروتئینαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته………………………………………………………………………………………………………………………………………  117

شکل 4-2-10- مطالعه فعالیت چاپرونی پروتئینαA -کریستالین طبیعی و تغییر یافته در حضور یون مس…………………………………………………………………………………………………………………….. 118