اثر نور لیزر در محدوده‌ی طول موج نور مرئی بر تولید آنتوسیانین درکشت سوسپانسیون سلولی سیب (Malus sp.)

مقدمه ……………………………………………………………………………………………………………………………..1

فصل اول: بررسی منابع

1-1- گیاه‌شناسی سیب ………………………………………………………………………………………………………4

1-2- رده بندی سیب ………………………………………………………………………………………………………..4

1-3- اهميت كشت بافت …………………………………………………………………………………………………5

1-3-1- بيوسنتز مواد در شرایط درون شيشه‌ای …………………………………………………………………..6

1-4- متابولیت‌های ثانویه ……………………………………………………………………………………………………9

1-5- طبقه بندی متابولیت‌های ثانویه …………………………………………………………………………………10

1-5-1- ترپن‌ها …………………………………………………………………………………………………………..10

1-5-2- ترکیبات نیتروژن‌دار ………………………………………………………………………………………….13

1-5-3- ترکیبات فنولی …………………………………………………………………………………………………13

1-6- فنیل آلانین در زیست ساختی اغلب فنول‌های گیاهی …………………………………………………..15

1-7- آنتوسیانین‌ها ……………………………………………………………………………………………………………17

1-7-1- آنتوسیانین و سلامت انسان‌‌ها ……………………………………………………………………………..19

1-7-2-  بیوسنتز آنتوسیانین در گیاهان ……………………………………………………………………………20

1-7-3- ژنتیک و بیوشیمی بیوسنتز آنتوسیانین ………………………………………………………………….23

1-7-3-1- چالکون سنتاز ……………………………………………………………………………………………23

1-7-3-2- فلاونون 3- هیدروکسیلاز ……………………………………………………………………………24

1-7-3-3- فلاونوئید‘3- هیدروکسیلاز و فلاونوئید ‘3،‘5- هیدروکسیلاز ………………………….25

1-7-3-4- دی هیدروفلاونول 4- ردوکتاز …………………………………………………………………….26

1-7-3-5- آنتوسیانیدین سنتاز………………………………………………………………………………………26

1-7-3-6- اوریدین دی‌فسفات-گلوکز: فلاونوئید 3-گلوکوزیل‌ترنسفراز ……………………………27

1-7-3-7- اوریدین دی‌فسفات-گلوکز: فلاونوئید 3-گلوکوزیل‌ترنسفراز ……………………………27

1-7-3-8- ژن های تنظیم کننده ……………………………………………………………………………………27

1-8- عوامل القای کننده بیوسنتز رنگریزه آنتوسیانین …………………………………………………………….28

1-8-1- دمای پایین ……………………………………………………………………………………………………….28

1-8-2-  القای اسموتیک ………………………………………………………………………………………………..28

1-8-3- عوامل القایی دیگر……………………………………………………………………………………………..29

1-8-4- القای نوری ………………………………………………………………………………………………………29

1-8-4-1- پرتوی ماورای بنفش …………………………………………………………………………………..31

1-8-4-2- نور آبی …………………………………………………………………………………………………….33

1-8-4-3- نور قرمز و قرمزدور ……………………………………………………………………………………37

1-9- لیزر ………………………………………………………………………………………………………………………39

1-9-1- طرز کار یک لیزر یاقوتی ……………………………………………………………………………………39

1-9-2- طبقه بندی لیزر در حالت کلی …………………………………………………………………………….41

1-9-3- دسته بندی لیزرها بر اساس طول موج و حداکثر توان خروجیشان ……………………………41

1-9-4- تقسم بندی لیزرها براساس ماده فعال یا محیط لیزرزا ……………………………………………..42

1-9-4-1- لیزر حالت جامد …………………………………………………………………………………………42

1-9-4-2- لیزر گازی …………………………………………………………………………………………………43

1-9-4-3- لیزر مایع یا رزینه ……………………………………………………………………………………….43

1-9-4-4- لیزر نیم رسانا ……………………………………………………………………………………………43

1-9-4-5- لیزر شیمیایی ……………………………………………………………………………………………..43

1-9-4-6- لیزر کی‌لیتی ………………………………………………………………………………………………43

1-9-5- کاربردهای لیزر………………………………………………………………………………………………..44

1-9-6- پژوهش در شیمی و زیست ‌شناختی ………………………………………………………………….45

1-9-7- کاربرد لیزر در کشاورزی …………………………………………………………………………………46

1-10- اهداف تحقیق ………………………………………………………………………………………………………49

فصل دوم: مواد و روش‌ها

2-1- مکان و زمان انجام آزمایش ………………………………………………………………………………………51

2-2- مواد گیاهی …………………………………………………………………………………………………………….51

2-3- تهیه‌ی محیط کشت ………………………………………………………………………………………………….51

2-4- تهیه‌ی محلول‌های تنظیم کننده‌ی رشد ……………………………………………………………………….52

2-5- روش استریل کردن …………………………………………………………………………………………………52

2-6- کشت جوانه‌ها و پرآوری گیاهچه‌های درون شیشه‌ای …………………………………………………..53

2-7- کالوس زایی ریز نمونه‌های برگی ………………………………………………………………………………54

2-8- تولید سلول‌های سوسپانسیونی از کالوس …………………………………………………………………….54

2-9- تعویض محیط کشت سلول‌های سوسپانسیونی …………………………………………………………….56

2-10- شرایط اتاق رشد ……………………………………………………………………………………………………56

2-11- شرایط رشد سلول‌های سوسپانسیونی روی شیکر……………………………………………………….57

2-12- اعمال تیمار نور لیزر آبی و قرمز……………………………………………………………………………….57

2-13- آماده‌سازی لوله‌های آزمایش جهت اعمال تیمار لیزری مناسب ……………………………………..59

2-14- اندازه‌گیری پارامترهای مورد نظر ……………………………………………………………………………..59

2-14-1- اندازه‌گیری رشد سلول‌های سوسپانسیونی ………………………………………………………….59

2-14-1-1- اندازه‌گیری وزن تر و خشک سلول ……………………………………………………………….60

2-14-1-2-  اندازه‌گیری تعداد سلول …………………………………………………………………………….61

2-14-1-3- اندازه‌گیری حجم سلول بعد از رسوب (CVS) ……………………………………………..62

2-14-1-4- اندازه‌گیری زنده مانی سلول ………………………………………………………………………64

2-14-1-4-1- تهیه محلول 4/0 درصد تریپان بلو …………………………………………………………64

2-14-2- اندازه‌گیری میزان آنتوسیانین سلول‌های سوسپانسیونی …………………………………………65

2-14-2-1- اندازه‌گیری میزان آنتوسیانین کل …………………………………………………………………….65

2-14 -2-2- اندازه‌گیری آنتوسیانین سلول‌های سوسپانسیونی به روش pH متغیر…………………..66

2-14-2-2-1- تهیه بافر پتاسیم کلرید و سدیم استات ……………………………………………………..67

2-15- تجزیه‌ی آماری داده‌ها …………………………………………………………………………………………….68

فصل سوم: بحث و نتایج

3-1- آنالیز پارامتریک صفت آنتوسیانین مونومریک اندازه گیری شده با روش pH متغیر تحت تاثیر تیمار لیزر آبی و قرمز ……………………………………………………………………………………………………….70

3-2- آنالیز پارامتریک صفت آنتوسیانین کل تحت تاثیر تیمار لیزر آبی و قرمز……………………………72

3-3- آنالیز صفت رشد سلول های سوسپانسیونی تحت تاثیرتیمار لیزر آبی و قرمز  ………………….73

3-3-1- آنالیز صفت حجم سلول بعد از رسوب (CVS) تحت تاثیر تیمار لیزر آبی و قرمز……..73

3-3-2- آنالیز صفت وزن تر و خشک سلول‌های سوسپانسیونی تحت تیمار لیزر آبی و قرمز……75

3-3-3- آنالیز صفت تعداد سلول‌های سوسپانسیونی تحت تاثیر تیمار لیزر آبی وقرمز………………77

3-3-4- آنالیز صفت زنده‌مانی سلول‌های سوسپانسیونی تحت تاثیر لیزر آبی و قرمز………………..78

3-4- آنالیز اثر زمان بر صفات CVS، وزن تر وخشک سلول‌های سوسپانسیونی تحت تیمار لیزر آبی و قرمز ……………………………………………………………………………………………………………………………..81

3-5- آنالیز تاثیر زمان بر صفات تعداد سلول و زنده‌مانی سلول‌های سوسپانسیونی تحت تیمار لیزر آبی و قرمز………………………………………………………………………………………………………………………..84

3-6- بحث و نتیجه‌گیری کلی از تاثیر لیزر آبی و قرمز بر رشدسلول و تولید آنتوسیانین در کشت سوسپانسیون سلولی سیب ………………………………………………………………………………………………….86

3-7- نتیجه‌گیری کلی ……………………………………………………………………………………………………….91

3-8- پیشنهادها ………………………………………………………………………………………………………………..92

منابع ………………………………………………………………………………………………………………………………..94

 

شکل1-1-  یک تصویر ساده از مسیرهای عمده زیست ساختی متابولیت‎‌های ثانویه و ارتباطات داخلی آنها با متابولیسم اولیه ………………………………………………………………………………………………11

شکل1-2- ساختار شیمیایی ترکیب فنولی …………………………………………………………………………..13

شکل 1-3- ساختار شیمیایی ترکیب فلاونوئیدها ………………………………………………………………….14

شکل 1-4- اسکلت کربنی پایه در فلاونوئیدها. فلاونوئیدها از فرآورده‌های دو مسیر اسید شیکمیک و اسیدمالونیک ساخته می‌شوند. …………………………………………………………………………………………15

شکل1-5- مسیرهای زیست ساختی فنول‌های گیاهی ……………………………………………………………16

شکل 1-6- نمایش فهرست‌وار زیست ساختی فنول از فنیل آلانین …………………………………………17

شکل1-7- طبقه بندی ساختار آنتوسیانین‌ها ………………………………………………………………………….19

شکل 1-8-  مسیر بیوسنتز آنتوسیانین …………………………………………………………………………………22

شکل1-9- طول موج‌های دریافتی توسط فتورسپتورها …………………………………………………………36

شکل1-10- مشخصات لیزر یاقوتی …………………………………………………………………………………….40

شکل 1-11- نوع لیزر و طول موج استفاده شده از آن در بخش کشاورزی ………………………………47

شکل 2- 1- گیاهچه های پرآوری شده سیب ……………………………………………………………………….54

شکل 2-2- توزین کالوس ها و انتقال آنها به فلاسک های حاوی محیط کشت مایع در زیر هود….55

شکل 2-3- شرایط اتاق رشد جهت رشد گیاهچه های سیب ………………………………………………….57

شکل2-4- اعمال تیمار نوری با لیزر آبی و قرمز ………………………………………………………………….58

شکل 2- 5- لوله آزمایش L شکل ………………………………………………………………………………………59

شکل 2-6- اندازه‌گیری میزان حجم سلول‌های سوسپانسیونی بعد از رسوب……………………………..63

شکل 2-7- تصاویر مربوط به صفحه‌ی مشبک هموسایتومتر…………………………………………………..63

شکل 2-8- دستگاه‌های مورد استفاده جهت استخراج و اندازه‌گیری آنتوسیانین………………………….67

نمودار 3-1- تاثیر لیزر آبی و قرمز بر تولید آنتوسیانین منومریک ……………………………………………70

نمودار3-2- تاثیر لیزر آبی و قرمز بر تولید آنتوسیانین کل ……………………………………………………..72

نمودار3-3- تاثیر تیمار لیزر آبی و قرمز بر میزان حجم سلول‌های سوسپانسیونی بعد از رسوب……74

نمودار3-5- تاثیر تیمار لیزر آبی و قرمز بر وزن خشک سلول‌های سوسپانسیونی……………………….76

نمودار3-6- تاثیر لیزر آبی و قرمز بر تعداد سلول‌های سوسپانسیونی………………………………………..77

نمودار3-7- تاثیر لیزر آبی و قرمز بر زنده‌مانی سلول‌های سوسپانسیونی…………………………………..78

نمودار3-8- تاثیر زمان بر صفت CVS در سلول‌های سوسپانسیونی تحت تیمار لیزر آبی و قرمز….81

نمودار3-9- تاثیر زمان بر وزن تر سلول‌های سوسپانسیونی تحت تیمار لیزر آبی و قرمز………………82

نمودار3-10- تاثیر زمان اندازه‌گیری بر صفت وزن خشک سلول‌های سوسپانسیونی تحت تیمار لیزر آبی و قرمز………………………………………………………………………………………………………………………..83

نمودار3-11- تاثیر زمان بر صفت تعداد سلول‌های سوسپانسیونی تحت تیمار لیزر آبی و قرمز……..84

نمودار3-12- تاثیر زمان بر صفت درصد زنده‌مانی سلول‌های سوسپانسیونی تحت تیمار لیزر آبی و قرمز…………………………………………………………………………………………………………………………………85

جدول 2-1- ترکیبات لازم ومقادیر آن‌ها برای تهیه یک لیتر محیط کشت  MS……………………………………….51

جدول 2-2- مراحل ضدعفونی جوانه‌های سیب …………………………………………………………………………………53

جدول3-1- جدول تجزیه واریانس آنتوسیانین منومریک تحت تیمار لیزر آبی و قرمز………………………………71

جدول3-2- مقایسه میانگین صفت آنتوسیانین منومریک تحت تاثیر تیمار لیزر آبی وقرمز………………………….71

جدول3-3- جدول تجزیه واریانس صفت آنتوسیانین کل تیمارها………………………………………………………….72

جدول3-4- جدول تجزیه واریانس صفت رشد سلول‌های سوسپانسیونی……………………………………………….79

جدول3-4- مقایسه میانگین صفت حجم سلولی بعد از رسوب (CVS) و وزن تر و خشک سلول‌های سوسپانسیونی ………………………………………………………………………………………………………………………………..80

جدول3-5- مقایسه میانگین صفت تعداد سلول و زنده‌مانی سلول‌های سوسپانسیونی………………………………..80