اثر فعال کننده¬های مسیر سیگنالینگ اصلی Wnt بر تمایز استئوژنیک سلول های بنیادی سوماتیک نامحدود(USSC)

فصل اول: مقدمه

1-1-  سلول­درمانی…………………………………………………………………………………………………………….1

1-2-  سلول‌های بنیادی……………………………………………………………………………………………………1

1-2-1- سلول‌های بنیادی جنینی……………………………………………………………………………………4

1-2-2- سلول‌های بنیادی بالغ…………………………………………………………………………………………5

1-2-3- سلول‌های بنیادی خون بند‌ناف…………………………………………………………………………..6

1-2-3-1- سلول‌هاي بنيادي سوماتیکی نامحدود(USSC)…………………………………………..7

1-3-  تمايز سلول‌هاي بنيادي به سمت سلول‌های استخوانی………………………………………….8

1-4-  مسیر پیام­رسانی Wnt……………………………………………………………………………………………9

1-4-1- مسیرهای پیام رسانی Wnt…………………………………………………………………………….10

1-4-2- اجزای مسیر اصلی Wnt………………………………………………………………………………….11

1-4-2-1- Frizzled(Fz)…………………………………………………………………………………………..13

1-4-2-2- LRP5/6…………………………………………………………………………………………………….13

1-4-2-3- Dvl……………………………………………………………………………………………………………..14

1-4-2-4- اکسین…………………………………………………………………………………………………………..14

1-4-2-5- GSK_3β………………………………………………………………………………………………….14

1-4-2-6- پروتئين مهار كننده تومورAPC…………………………………………………………………15

1-4-2-7- بتاکتنین……………………………………………………………………………………………………….15

1-4-2-8- sFRP………………………………………………………………………………………………………….16

1-4-2-9- Dkk……………………………………………………………………………………………………………17

1-5-            ژن­های هدف مسیر Wnt……………………………………………………………………………………18

1-6-            فعال کننده­های مسیر سیگنالینگ Wnt…………………………………………………………….18

1-6-1- BIO…………………………………………………………………………………………………………………19

1-7- سلول­هاي بنيادي جنيني و مسير پيام رساني Wnt………………………………………19

1-8- تمایز آدیپوسیتی و استئوبلاستی و مسير پيام­رساني Wnt……………………………….20

1-9-  هدف از انجام پژوهش…………………………………………………………………………………………..22

فصل دوم: مواد و روش­ها

2-1- مواد و دستگاه­های مورد استفاده………………………………………………………………………….24

2-2-  سلول‌های بنیادی سوماتیک نامحدود…………………………………………………………………..26

2-3-  محلول­های مورد استفاده در کشت سلول­های بنیادی سوماتیکی نامحدود………..26

2-4-  محیط کشت کامل جهت نگهداری سلول­های بنیادی سوماتیکی نامحدود………..26

2-5-  تعويض محيط كشت سلول­های بنیادی سوماتیکی نامحدود………………………………26

2-6-  پاساژ سلول‌های بنیادی سوماتیکی نامحدود……………………………………………………….27

2-7-  منجمد کردن سلول‌های بنیادی سوماتیکی نامحدود………………………………………….27

2-8-  ذوب کردن سلول‌های بنیادی سوماتیکی نامحدود……………………………………………..28

2-9-  شمارش سلول­ها به روش تریپان بلو……………………………………………………………………28

2-10-                     محیط کشت تمایزی سلول‌های بنیادی سوماتیکی نامحدود به استخوان………..29

2-11-                     رنگ­آمیزی سلول‌های استخوانی………………………………………………………………………..30

2-11-1-        پروتکل آماده سازی رنگ آلیزارین رد………………………………………………………….30

2-11-2-        پروتکل رنگ­آمیزی آلیزارین رد……………………………………………………………………30

2-12-                    سنجش ماتریکس استخوان……………………………………………………………………………….30

2-12-1-          مراحل کار سنجش ماتریکس استخوان………………………………………………………….31

2-13- اندازه‌گيری فعاليت آلکالين فسفاتاز…………………………………………………………………..31

2-14- اندازه‌گيری ميزان رسوبات کلسيم‌دار………………………………………………………………..32

2-15- رنگ­آمیزی سلول­های چربی……………………………………………………………………………..32

2-15-1-         پروتکل آماده سازی رنگ Oil red……………………………………………………………….32

2-15-2-         پروتکل رنگ­آمیزی با Oil red……………………………………………………………………..32

2-16-                     ایمونوسیتوشیمی…………………………………………………………………………………………………..33

2-16-1-         مواد لازم برای آزمایش ایمونوسیتوشیمی……………………………………………………….33

2-16-1-1- طرز تهيه پارافرمالدهيد 4%………………………………………………………………………..33

2-16-1-2- طرز تهيه  x 100‏Triton 04/0% در بافر PBS…………………………………….34

2-16-1-3- طرز تهيه BSA/PBS 3%……………………………………………………………………….34

2-16-1-4- طرز تهيهTween 20……………………………………………………………………………….34

2-16-2-         مراحل ايمونوسيتوشيمي…………………………………………………………………………………34

2-17-                     بررسی بیان ژن­های تمایزی با استفاده از تکنیکreverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)………………………………………………………….35

2-17-1-         مراحل انجام RT-PCR…………………………………………………………………………………35

2-17-1-1- استخراجRNA …………………………………………………………………………………………35

2-17-1-2- سنتز cDNA (complementary DNA)………………………………………..37

2-17-1-3- واکنش زنجیره پلی مرازی (PCR)………………………………………………………….37

2-17-2-         بار گیری نمونه‌ها روی ژل الکتروفورز……………………………………………………………..39

2-18- بررسی کمی بیان ژنهای تمایزی با تکنیک Real time PCR……………………..40

2-18-1-         Real- time PCR در مقابل PCR معمولی……………………………………………..40

2-18-2-         تعریف Real-time PCR…………………………………………………………………………….40

2-18-3-         اساس تکنیک Real-time PCR………………………………………………………………..41

2-18-4-         آماده سازی نمونه­ها…………………………………………………………………………………………42

2-19-                     آنالیز های آماری………………………………………………………………………………………………..42

فصل سوم: نتایج

3-1- مورفولوژی و فنوتیپ سلول­های بنیادی USSC…………………………………………………43

3-2- تمایز سلول­های بنیادی USSC به سلول­های استخوانی……………………………………43

3-3- اثرBIO به عنوان مهار کننده  GSK_3βدر تمایزسلول های USSCبه سلول­های استخوانی………………………………………………………………………………………………………………….44

3-4- تمایز چربی سلول­های USSC در اثر مهار تمایز استخوانی با BIO………………….47

3-5- بررسی فعالیت بتاکتنین در حضور BIO……………………………………………………………..49

3-6- سنجش میزان رسوبات کلسیم………………………………………………………………………………51

3-7- فعالیت آلکالین فسفاتاز………………………………………………………………………………………….53

3-8- سنجش ماتریکس استخوانی………………………………………………………………………………….54

3-9- بررسی بیان ژن………………………………………………………………………………………………………55

فصل چهارم: بحث

بحث………………………………………………………………………………………………………………………………….58

4-1- BIO باعث افزایش بتاکنین هسته­ای می­شود……………………………………………………..59

4-2- BIO باعث مهار تمایز استخوانی می­شود……………………………………………………………..60

4-3- همزمان با مهار تمایز استخوانی، القای تمایز چربی در عدم حضور محیط القاکننده چربی صورت می­گیرد……………………………………………………………………………………………………….62

فصل پنجم: منابع

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………….64