مطالعه و شناسایی سویه های باکتریایی تولیدکننده کوتیناز

تعداد 124 صفحه فایل word قابل ویرایش

Site: www.filenaab.ir

مطالعه و شناسایی سویه­های باکتریایی تولیدکننده کوتیناز

چکیده

  کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می­کند. کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی­استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته­اند. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 هستند و حاوی یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقش کلیدی درحفاظت از گیاهان در برابر عوامل بیماریزا ایفا می کند و تجزیه­ی آنزیمی آن اولین گام در فرآیند آلودگی بافت گیاهی است. هدف از این پژوهش استخراج کوتین و مقایسه­ی آنها در میوه­های مختلف و غربالگری باکتری­ها و قارچ­های تولید کننده آنزیم کوتیناز و شناسایی گونه آنها با تعیین توالی ناحیه   16S DNA می­باشد. با توجه به اهمیت آنزیم کوتیناز به ویژه در صنعت، این مطالعه گامی مهم در شناسایی سویه­های بومی تولید کننده آنزیم کوتیناز و استفاده از آنها در صنعت به شمار می­آید. بدین منظور پوست میوه­های مختلف را جمع­آوری و در بافر اگزالات جوشانده و بعد از شست­و­شو در آون خشک شده و آسیاب گردید. از پودر حاصل به روش کلرفرم متانول کوتین آن جداسازی شد. نتایج نشان می­داد که درصد کوتین استخراج شده در سیب بیشتر است و احتمالا سیب نسبت به آفات و بیماری­ها مقاوم­تر است. در مرحله­ی بعد جداسازی سویه­ای تولیدکننده آنزیم از نمونه­های مختلف انجام شد. نمونه­ها به داخل پلیت های حاوی محیط کشتی که کوتین تنها منبع کربن است تلقیح داده و سویه­های غربالگری شده و به کمک سوبسترای اختصاصی پارانیتروفنول بوتیرات فعالیت کوتینازی سنجیده شد. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 6 سویه جداسازی شده با استفاده از نشانگر RAPD مورد مطالعه قرار گرفتند. به این منظورDNA ژنومی از سویه­های تولیدکننده آنزم کوتیناز به روش جوشاندن، CTAB و کیت استخراج شد و واکنش PCR با استفاده از 9 آغازگر  RAPD انجام گردید. برای شناسایی و توالی یابی سویه­ها با استفاده از rDNA 16S  عمل PCR  با دو پرایمر 8F و  1541Rانجام شد سپس محصولات PCR برای توالی یابی ارسال شد. این مطالعات نشان می­دهد که سویه­های جداسازی شده دارای فعالیت کوتینازی مناسبی بوده و میزان بالایی از آنزیم کوتیناز را تولید می­کنند که قابلیت مصارف تجاری صنعتی دارند.

كلمات كليدي: کوتین، آنزیم کوتیناز، سنجش فعالیت آنزیمی، تنوع ژنتیکی، نشانگر RAPD

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                                                صفحه

 فصل اول  معرفی.. ۱

۱- ۱- مقدمه. ۲

۱- ۲- اهمیت و ضرورت تحقیق.. ۲

۱- ۳- فرضیات واهداف تحقیق.. ۴

 فصل دوم  مروری بر کلیات و تحقیقات پیشین.. ۶

۲- ۱- کوتین.. ۷

۲- ۱- ۱- جداسازی کوتین.. ۱۲

۲- ۱- ۲- دپلیمریزاسیون کوتین.. ۱۲

۲- ۱- ۳- مونومرهای تشکیل دهنده کوتین.. ۱۳

۲- ۳- آنزیم کوتیناز ۱۶

۲- ۳- ۱- کلون و بیان کوتیناز ۱۸

۲- ۳- ۲- ساختار کوتیناز ۱۹

۲- ۳- ۳- عملکرد کوتیناز ۲۶

۲- ۳- ۴- کاربردهای کوتیناز ۲۷

۲- ۳- ۵- استفاده از کوتیناز به عنوان یک بیوکاتالیست در محیطهای غیرمعمول. ۲۹

۲- ۳- ۶- عملکرد کوتیناز در واکنشه­ای هیدرولیزی و سنتزی.. ۳۳

۲- ۳- ۷- ترانس استریفیکاسیون. ۳۵

۲- ۳- ۸- پایداری کوتیناز ۳۶

۲- ۳- ۹- فرایندهای در حال توسعه: بیوراکتور کوتیناز ۳۸

۲- ۳- ۱۰- مکانیسم عمل کوتیناز ۳۹

۲- ۳- ۱۱- مقایسه­ی آنزیم کوتیناز قارچی و باکتریایی.. ۴۱

۲- ۴- نشانگرهای ژنتیکی.. ۴۲

۲- ۵- نشانگرهای مورفولوژیکی.. ۴۲

۲- ۶- نشانگرهای مولکولی.. ۴۳

۲- ۷- نشانگرهای پروتئینی یا بیوشیمیایی.. ۴۴

۲- ۸- نشانگرهای DNA.. 45

۲- ۸- ۱- نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR.. 46

۲- ۸- ۲- نشانگرهای مبتنی بر PCR.. 46

۲- ۹- نشانگرهای غیر اختصاصی.. ۴۷

۲- ۹- ۱- RAPD.. 47

۲- ۱۰- نشانگرهای اختصاصی.. ۴۸

۲- ۱۰- ۱- AFLP. 48

۲- ۱۰- ۲- SSR.. 48

۲- ۱۰- ۳- RFLP-PCR.. 50

۲- ۱۰- ۴- RFLP Based PCR با اتصال ناقص… ۵۱

 فصل سوم  مواد، تجهیزات و روش تحقیق.. ۵۲

۳- ۱- استخراج کوتین.. ۵۵

۳- ۲- نمونه برداری.. ۵۵

۳- ۳- غربالگری و جداسازی گونه­های تولیدکننده آنزیم کوتیناز ۵۵

۳- ۴- تهیه slant از سویه­های جدا شده ۵۷

۳- ۵- نگهداری طولانی مدت سویه­ها ۵۷

۳- ۶- تهیه گلیسرول. ۵۸

۳- ۷- تهیه محیط کشتLB.. 58

۳- ۸- Assay آنزیمی.. ۵۸

۳- ۹- Assay ویژه آنزیمی.. ۶۰

۳- ۱۰- استخراج DNA.. 60

۳- ۱۰- ۱- استخراج DNA  به روش جوشاندن. ۶۰

۳- ۱۰- ۲- استخراج DNA به رو ش CTAB.. 61

۳- ۱۰- ۳- روش استخراج DNA با کیت.. ۶۴

۳- ۱۱- اندازه­گیری کیفیت و غلظت DNA.. 65

۳- ۱۲- رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید. ۶۹

۳- ۱۳- واکنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reaction. 70

۳- ۱۴- راه اندازی واکنش PCR.. 74

۳- ۱۵- برنامهPCRبرای نشانگرRAPD.. 76

۳- ۱۶- توالی­یابی سویه­های تولیدکننده آنزیم کوتیناز با استفاده از ۱۶S rDNA.. 77

۳- ۱۷- الکتروفورز محصولات واکنش PCR.. 78

فصل چهارم. ۸۰

۴- ۱- بررسی میزان کوتین در میوه­های مختلف.. ۸۱

۴- ۲- جداسازی سویه­ها ۸۷

۴- ۳- بررسی فعالیت آنزیم کوتیناز در نمونه­ها ۸۷

۴- ۴- نتایج بررسی کیفیت DNA بعد از استخراج. ۸۸

۴- ۵- تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی ۶ سویه بر اساس نشانگر مولکولی RAPD.. 89

۴- ۶- نتایج حاصل از تجزیه خوشه­ای بر اساس نشانگر RAPD.. 89

۴- ۷- تجزیه به مختصات اصلی.. ۹۰

۴- ۸- نتایج تجزیه باندهای حاصل از ۸ پرایمر RAPD.. 92

۴- ۹- ضریب همبستگی کوفنتیک… ۹۳

۴- ۱۰- شناسایی و توالی یابی سویه­ها با استفاده از ۱۶S rDNA.. 93

 فصل پنجم. ۹۵

۵- ۱- استخراج کوتین.. ۹۶

۵- ۲- سنجش فعالیت آنزیمی کوتیناز ۹۷

۵- ۳- استخراج DNA.. 98

۵- ۴- تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر RAPD.. 98

پیشنهادات.. ۱۰۰

۶- ۱- پیشنهادات.. ۱۰۱

 

فهرست جدول‌ها

عنوان                                                                                                                                                صفحه

جدول ‏۲‑۱ مطالعه ساختار- عملکرد کوتیناز به کمک تکنی­کهای مختلف… ۲۴

جدول ‏۲‑۲ فعالیت هیدرولازی کوتیناز نسبت به تنوع گستردهای از سوبستراها ۲۹

جدول ‏۲‑۳ روش­های آماده­سازی کوتیناز ۳۰

جدول ‏۳‑۱ مواد مورد استفاده در پایان­نامه. ۵۳

جدول ‏۳‑۲ مشخصات کامل مواد شیمیایی مورد نیاز در عملیات استخراج DNA… 61

جدول ‏۳‑۳ مواد مورد استفاده برای تهیه بافر TBE(10X) 68

جدول ‏۳‑۴ مشخصات پرایمرهای RAPD… 73

جدول ‏۳‑۵ مواد مورد نیاز PCR.. 75

جدول ‏۳‑۶ مواد مورد نیاز PCR با مستر میکس اماده ۷۶

جدول ‏۳‑۷ برنامه واکنش PCR مورد استفاده برای نشانگر RAPD… 76

جدول ‏۳‑۸ برنامه واکنش PCR برای پرایمرهای ۱۶S rDNA.. 77

جدول ‏۳‑۹ مواد مورد نیاز برای انجام PCR 6 نمونه با پرایمرهای۱۶S rDNA.. 78

جدول‏۳‑۱۰ ۱۶S rDNA primer. 78

جدول ‏۴‑۱بررسی میزان کوتین.. ۸۲

جدول ‏۴‑۲ بررسی میزان کوتین در خیارسبز. ۸۳

جدول ‏۴‑۳ بررسی میزان کوتین در سیب زرد. ۸۴

جدول ‏۴‑۴ بررسی میزان کوتین در سیب قرمز. ۸۵

جدول ‏۴‑۵ تجزیه واریانس وزن کوتین نهایی بین میوه­ها ۸۵

جدول‏۴‑۶ مقایسه میانگین میوه­ها به روش دانکن در سطح احتمال ۱% برای صفت وزن کوتین نهایی.. ۸۶

جدول ‏۴‑۷ فعالیت کوتینازی ۶ نمونه. ۸۸

جدول ‏۴‑۸  نتایج پرایمرهای RAPD حاصل از الکتروفورز افقی نمونه­ها ۸۹

 

فهرست شکل‌ها

عنوان                                                                                                                                                صفحه

شکل ‏۲‑۱ ترسیم نمای ساختمان پوستک گیاه A) مرحله گستردگی کامل برگ B) تصویری با میکروسکوپ الکترونی از پوستک برگ بزرگنمایی ۵۱۰۰۰ برابر. ۹

‏۲‑۲ مولکول کوتین و مونومرهایی که از هیدرولیز آن بدست می آید. ۱۰

شکل ‏۲‑۳ نمایش شماتیکی از کوتیکول.. ۱۱

شکل ‏۲‑۴ a) ساختمان غیر مشخص و بینظم کوتیکول با میکروسکوپ الکترونی b) برآمدگی­های کوتین میوه گوجه­فرنگی با میکروسکوپ الکترونی   ۱۱

شکل ‏۲‑۵ a) توالی پروتئینی آنزیم کوتیناز b) مکانیسم عمل آنزیم کوتیناز ۱۶

شکل ‏۲‑۶ هیدرولاز آلفا و بتا ۲۰

شکل ‏۲‑۷ ساختار کوتیناز ۲۱

شکل ‏۲‑۸ توانایی تجزیه (a) و سنتز(b) ترکیبات پلی استری توسط آنزیم کوتیناز ۲۸

شکل‏۲‑۹ مکانیسم عمل کوتیناز ۴۰

‏۲‑۱۰ گسترهی مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما وpH 41

شکل ‏۲‑۱۱نمودار دما و pH… 41

شکل ‏۲‑۱۲ دسته­بندی نشانگرهای ژنتیکی.. ۴۴

شکل ‏۳‑۱ تهیه ژل آگارز ۶۸

شکل ‏۴‑۱مراحل مختلف استخراج کوتین در گوجه­فرنگی.. ۸۱

شکل ‏۴‑۲ مراحل مختلف استخراج کوتین در خیارسبز. ۸۲

شکل ‏۴‑۳ مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب زرد. ۸۳

شکل ‏۴‑۴ مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب قرمز. ۸۴

شکل ‏۴‑۵ مقایسه میزان کوتین.. ۸۶

شکل ‏۴‑۶ میزان فعالیت سویه­ها ۸۸

شکل ‏۴‑۷ دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای ۹ پرایمر RAPD با روش UPGMA… 90

شکل ‏۴‑۸ پلات دوبعدی حاصل از تجزیه به مولفه­های اصلی نشانگر RAPD… 91

شکل ‏۴‑۹پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مولفه­های اصلی نشانگر RAPD… 92

شکل ‏۴‑۱۰ ژل الکتروفورز افقی با آگارز ۱% با استفاده از پرایمرها ۹۳

شکل ‏۴‑۱۱ژل الکتروفورز با آگارز ۱% با پرایمرهای ۱۶S rDNA.. 94

نقد و بررسی‌ها

هیچ دیدگاهی برای این محصول نوشته نشده است.

اولین کسی باشید که دیدگاهی می نویسد “مطالعه و شناسایی سویه های باکتریایی تولیدکننده کوتیناز”
قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
Loading...