بررسی تغییرات پروفایل پروتئومیکس در دو روش کشت Batch، Fed- batch در باکتری E. coli بیان کننده Fab Fragment ضد VEGF قبل از شروع فاز سریع رشد

تعداد   174    صفحه در فایل word

عنوان:

مقدمه: امروزه تولید پروتئین‌های نوترکیب خصوصا آنتی‌بادی‌های مونوکلنال به منظور تشخیص و درمان بیماری‌ها از چالش‌های اساسی در صنایع بزرگ دارویی می‌باشد. به همین منظور رسیدن به سطح بیان بالا در پروسه‌های صنعتی بسیار حائز اهمیت است. این سطح بیان بالا باید با تاخوردگی و تغییرات پس ترجمه‌ای مناسب و همچنین قابلیت تولید در مقیاس بالا همراه باشد. امروزه بخش عمده محصولات نوترکیب در صنایع دارویی در دو میزبان سلول‌های پستانداران و باکتری اشریشیا کلای تولید می‌شوند.

  1. coli با ژنتیک شناخته شده، رشد سریع، محیط کشت ساده و ارزان، زمان کشت کوتاه، Scale up آسان برای فرمانتاسیون و توانایی تولید پروتئین‌های غیر گلیکوزیله خصوصا قطعات آنتی‌بادی Fab و ScFv ، یکی از مهم‌ترین و پرکاربردترین میزبان‌های بیانی محسوب می‌شود. بیان پروتئین درE. coli محدودیت‌هایی چون ناتوانی در تشکیل تغییرات پس از ترجمه، ناکارآمدی در بلوغ پروتئین ها بواسطه پروتئولیز و پیوند دی‌سولفیدی را به همراه دارد.

راه‌کارهای متفاوتی برای بهبود Folding پروتئین در E. coli وجود دارد که یکی از مهم‌ترین آن‌ها اصلاحات در سیستم کشت است. استفاده از محیط Fed-batch نسبت به کشت سنتی Batch، منجر به دانسیته سلولی بالا به همراه بازده بیشتر پروتئین نوترکیب می‌شود. در سیستم Fed-batch به دلیل رشد کنترل شده، PH در تمام مدت کشت در سطح دلخواه باقی مانده و تجمع استات و سایر متابولیت‌های مضر نیز به حداقل می‌رسد و از بروز شرایط بی‌هوازی جلوگیری می‌شود. محیط Fed-Batch مورد استفاده در این پایان نامه EnBase می‌باشد که در آن فعالیت آنزیماتیک گلوکز بین نمک‌های معدنی و سایر ترکیبات تعادل ایجاد کرده و منجر به تولید بیشتر پروتئین به فرم محلول می‌شود.

نمونه‌ی مورد مطالعه در این پایان نامه، قطعه Anti-VEGF برای درمان بیماری چشمی AMD،  بیان شده در E. coli BL21 است که محیط احیای سیتوپلاسم آن به محیط اکسیداتیو تبدیل شده‌است. با استفاده از پروتئومیکس کلیه پروتئین‌های بیان شده توسط E. coli بر روی ژل 2DE تفکیک شده و میزان بیان پروتئین ها در دو محیط Batch و EnBase مشاهده شدند. سپس تمام نقاط پروتئینی موجود روی تصاویرژل ها توسط نرم افزار Image master بررسی شده و نقاط منتخب با استفاده از طیف سنجی جرمی پروتئین ها تعیین هویت می‌شوند و می‌توان متوجه شد که میزان بیان چه پروتئین‌هایی در کشت EnBase نسبت به Batch تغییر کرده‌است. در صورت شناخت دقیق‌تر پروتئین‌های کلیدی دخیل در مسیر بیان و رشد سلول قادر به دستورزی هدفمند ژن‌های کد کننده این پروتئین‌ها و در نتیجه رسیدن به پروفایل رشد و بیان مناسب قطعه آنتی‌بادی مورد نظر خواهیم بود.

نتایج: با بررسی تغییرات پروفایل پروتئومیکس در دو روش کشت EnBase و Batch قبل از شروع فاز سریع رشد، چهار پروتئین با تغییر در میزان regulation شناسایی شدند. نقطه پروتئینی شماره 6005 مربوط به پروتئین maeA Malic enzyme, NAD-dependent، نقطه شماره 5924 مربوط به پروتئین astC Succinylornithine transaminase و نقطه 4927 مربوط به پروتئین  argD Acetylornithine aminotransferase که در روش کشت EnBase نسبت به Batch، up regulate شدند و نقطه شماره 4589 مربوط به پروتئین malS alpha-Amylase, periplasmic که تنها در روش کشت Batch بیان شده و در سیستم EnBase وجود نداشت. آنزیم مالیک (ME)، دکربوکسیلاسیون اکسیداتیو L-malate به پیروات و CO2 را با کاهش کوفاکتور NADP+ در حضور کاتیون دو ظرفیتیMn2+ در چرخه کربس، کاتالیز می‌کند. up regulation این آنزیم نشان‌دهنده فعالیت بالای چرخه کربس در محیط EnBase نسبت به محیط Batch است و متعاقب آن در محیط EnBase نسبت به محیط Batch دانسیته سلولی بالاتری را مشاهده می‌کنیم. Succinylornithine transaminase در کاتابولیسم آرژنین و پرولین شرکت می‌کند. در محیط EnBase دانسیته سلولی به شدت افزایش می‌یابد و درنتیجه نیاز به منبع نیتروژن نیز افزایش می‌یابد.

Acetylornithine aminotransferase در چرخه‌ی اوره و در متابولیسم گروه‌های آمینو دخالت می‌کند و مراحل آمیناسیون را در بیوسنتز لایزین، ارنیتین و آرژنین، کاتالیز می‌کند. Up regulation آنزیم Acetylornithine aminotransferase در محیط EnBase نسبت به محیط Batch، نشان‌دهنده دانسیته سلولی بالا و نیاز سلول‌ها به سنتز اسیدهای آمینه جهت استفاده به‌عنوان منبع نیتروژن است.

آلفا آمیلاز پری‌پلاسمیک اشریشیاکلای، مالتودکسترین‌های خطی را هیدرولیز می‌کند. در محیط Batch به‌دلیل وجود کنترل نشده و فراوان مواد غذایی، بیان این پروتئین به شدت افزایش داشته تا بتواند مواد نشاسته‌ای موجود در محیط را شکسته و در اختیار باکتری‌ها قرار دهد. این آنزیم در فاز پیش از القا در محیط EnBase اصلا بیان نشده‌است که این می‌تواند به‌دلیل انتشار آهسته و نبود مواد نشاسته‌ای فراوان در ابتدای کشت باشد.

بحث: با توجه به نقش کلیدی پروتئین‌های تعیین هویت شده، می‌توان نتیجه گرفت که بیشترین افزایش تنظیم در سطح پروتئین‌هایی صورت گرفته که عملکرد آن‌ها منجر به تولید انرژی و بیوسنتز و کاتابولیسم اسیدهای آمینه به‌عنوان منبع نیتروژن است. بنابراین با دست‌ورزی ژنتیکی این پروتئین‌های درون سلولی، شاید بتوان بیان پروتئین محلول را افزایش داد. همان‌طور که قبلا نیز ذکر شد، تولید پروتئین به فرم محلول هدف اصلی بیان این پروتئین‌ها در سیستم بیانی E. coli می‌باشد. با افزایش بیان پروتئین‌های درون سلولی دخیل در تولید انرژی و منبع نیتروژن، می‌توان به دانسیته سلولی بالاتر و درنتیجه تولید پروتئین‌های نوترکیب به فرم محلول دست یافت.

تعداد     ۱۷۴  صفحه در فایل   word

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                   صفحه

فصل اول – مقدمه و کلیات۱

۱-۱- اهمیت پروتئین‌های نو ترکیب در تشخیص و درمان. ۱

۱-۲- میزبانهای بیانی رایج برای پروتئین‌های نوترکیب… ۴

۱-۲-۱- مخمرها ۵

۱-۲-۱-۱- مزایای استفاده از مخمر. ۷

۱-۲-۱-۲- معایب استفاده از مخمر. ۷

۱-۲-۲- سلول‌های حشرات… ۷

۱-۲-۲-۱- مزایای سیستم بیان سلول baculovirus-assisted insect 8

۱-۲-۳- سلول‌های پستانداران. ۹

۱-۲-۴- سیستم‌های بیانی میکروبی.. ۱۱

۱-۲-۴-۱- باکتری‌های گرم مثبت… ۱۱

۱-۲-۴-۱-۱- مزایای استفاده از سیستم بیانی باسیلوس… ۱۲

۱-۲-۴-۲- باکتری‌های گرم منفی.. ۱۳

۱-۲-۴-۲-۱- E. coli ۱۵

۱-۲-۴-۲-۱-۱- اهمیت میزبان بیانیE. coli در تولید پروتئین‌های نوترکیب به خصوص قطعات آنتی‌بادی   ۱۶

۱-۲-۴-۲-۱-۲ پروتئین‌های نوترکیب بیان شده در E. coli ۱۷

۱-۲-۴-۲-۱-۳- مزایای استفاده از E. coli ۲۸

۱-۲-۴-۲-۱-۴- معایب استفاده از E. coli ۲۸

۱-۲-۴-۲-۱-۵- راه حل‌ها و مطالعات انجام شده در خصوص بهینه سازی بیان در E. coli ۳۰

۱-۳- روش بیانی Fed-batch و مزایای آن نسبت به روش‌های معمول. ۳۳

۱-۳-۱- محیط Fed-batch) EnBase). 34

۱-۴- قطعه‌ی آنتی‌بادی fab fragment مورد بررسی در این پایان‌نامه. ۳۴

۱-۵- جایگاه پروتئومیکس در بررسی پروتئین‌های درون سلولی دخیل در مسیرهای مختلف با هدف مهندسی میزبان در راستای بیان پروتئین‌های عملکردی.. ۳۶

۱-۶- طرح موضوع. ۳۷

۱-۷- بیان مساله. ۳۹

۱-۸- ضرورت انجام تحقیق.. ۴۰

۱-۹- اهداف… ۴۰

۱-۱۰- سؤالات و فرضیه‌ها ۴۱

۱-۱۱- تعریف واژگان. ۴۱

فصل دوم – ادبیات و مستندات۴۲

فصل سوم – مواد و روش۵۰

۳-۱- دستگاه‌ها، مواد و ابزار مورد استفاده ۵۰

۳-۱-۱- فهرست دستگاه‌های مورد نیاز برای انجام تحقیق.. ۵۰

۳-۱-۲- باکتری مورد استفاده ۵۱

۳-۱-۳- فهرست مواد استفاده شده ۵۱

۳-۱-۴- فهرست ابزار استفاده شده ۵۱

۳-۲- روش کار. ۵۲

۳-۲-۱- انتقال وکتور به باکتری(transfer). 52

۳-۲-۲- آماده سازی ظروف و محیط‌های کشت برای کشت‌های Batch. 53

۳-۲-۳- آماده سازی ظروف برای کشت‌های EnBase. 53

۳-۲-۴- تهیه محیط کشت اولیه (pre-culture). 54

۳-۲-۵- تهیه محیط کشت برای کشت‌های EnBase و تلقیح آن‌ها ۵۴

۳-۲-۶- تلقیح کشت‌های Batch. 54

۳-۲-۷- فاز اول، جداسازی نمونه‌های القا نشده ۵۵

۳-۲-۸- القای نمونه‌ها ۵۵

۳-۲-۹- فاز دوم، جداسازی پلت باکتری شش ساعت پس از القا ۵۵

۳-۲-۱۰- فاز سوم، جداسازی پلت باکتری ۲۴ ساعت پس از القا ۵۵

۳-۲-۱۱- SDS Phcage از پلت باکتری به منظور بررسی بیان. ۵۵

۳-۲-۱۱-۱- نحوه بستن شیشه‌ها ۵۶

۳-۲-۱۱-۲- ساخت ژل Resolving. 56

۳-۲-۱۱-۳- ساخت فاز دوم ژل ( Stacking). 57

۳-۲-۱۱-۴- محاسبه میزان نمونه برای تزریق به چاهک‌ها ۵۸

۳-۲-۱۱-۵- آماده سازی نمونه برای تزریق به چاهک‌ها ۵۸

۳-۲-۱۱-۶- آماده سازی ژل‌ها جهت تزریق نمونه. ۵۸

۳-۲-۱۱-۷- تزریق نمونه به چاهک‌ها ۵۹

۳-۲-۱۱-۸- ران کردن ژل‌ها ۶۰

۳-۲-۱۱-۹- رنگ‌آمیزی و اسکن ژل‌ها ۶۰

۳-۲-۱۲- شستشوی نمونه‌ها جهت آماده سازی برای لیز. ۶۰

۳-۲-۱۳- لیز کردن باکتری‌ها ۶۱

۳-۲-۱۳-۱- لیز به‌وسیله بافر لیز کننده ۶۱

۳-۲-۱۳-۲- افزودن Dithithreitol (DTT) به استوک لایزز بافر. ۶۱

۳-۲-۱۳-۳- افزودن محلول PMSF و اتانول ۱۰۰%. ۶۲

۳-۲-۱۳-۴- میزان لایزز بافر مورد استفاده ۶۲

۳-۲-۱۴- سونیکاسیون. ۶۲

۳-۲-۱۵- حذف اسید‌های نوکلئیک و ترکیبات اضافی دیگر. ۶۳

۳-۲-۱۶- افزودن TCA به سوپ باکتری.. ۶۴

۳-۲-۱۷- شستشو با استن ۲۰-. ۶۴

۳-۲-۱۸- حل کردن پلت‌ها در بافر آبرسانی.. ۶۴

۳-۲-۱۸-۱- ساخت بافر آبرسانی.. ۶۴

۳-۲-۱۸-۲- افزودن DTT در هنگام استفاده ۶۵

۳-۲-۱۸-۳- افزودن محلول به پلت‌ها ۶۵

۳-۲-۱۹- ثبت جذب نوری (OD) برای تمام نمونه‌ها ۶۵

۳-۲-۱۹-۱- نحوه استفاده از Bradford reagent: 66

۳-۲-۲۰- SDS Page از سوپ باکتری بعد از افزودن TCA.. 66

۳-۲-۲۰-۱- محاسبه میزان نمونه. ۶۷

۳-۲-۲۰-۲- نحوه‌ی ساخت Luding 1X.. 67

۳-۲-۲۰-۳- آماده سازی نمونه برای تزریق به چاهک‌ها ۶۷

۳-۲-۲۰-۴- ران ژل‌ها ورنگ‌آمیزی و اسکن.. ۶۷

۳-۲-۲۱- محاسبه نمونه برای بعد اول الکتروفورز. ۶۸

۳-۲-۲۲- قرار گیری نمونه‌ها روی نوار‌های IPG.. 68

۳-۲-۲۳- آماده سازی ژل. ۷۱

۳-۲-۲۳-۱- آماده سازی شیشه‌های مخصوص ریختن ژل‌های ۱۷ سانتی‌متری.. ۷۱

۳-۲-۲۳-۲- آماده سازی مواد ژل. ۷۱

۳-۲-۲۳-۳- ریختن ژل گرادیان. ۷۲

۳-۲-۲۳-۴- ریختن اِن-بوتانول روی ژل‌ها ۷۳

۳-۲-۲۳-۵- استفاده از Gel storage. 73

۳-۲-۲۴- بعد دوم الکتروفورز. ۷۴

۳-۲-۲۴-۱- آماده سازی نوارهای IPG برای قرار گیری روی ژل توسط بافر متعادل کننده ۷۴

۳-۲-۲۴-۲- مرحله اول متعادل سازی.. ۷۴

۳-۲-۲۴-۳- مرحله دوم متعادل سازی.. ۷۵

۳-۲-۲۵- آماده سازی آگارز. ۷۵

۳-۲-۲۶- قرار دادن نوار‌های IPG روی سطح ژل. ۷۶

۳-۲-۲۶-۱- آماده سازی تانک بافر ۱X.. 76

۳-۲-۲۶-۲- ران کردن ژل‌ها ۷۶

۳-۲-۲۷- فیکس کردن ژل‌ها ۷۷

۳-۲-۲۸- رنگ‌آمیزی نیترات نقره ۷۷

۳-۲-۲۸-۱- مرحله اول: شستشو. ۷۷

۳-۲-۲۸-۲- مرحله دوم: حساس کردن. ۷۷

۳-۲-۲۸-۳- مرحله سوم: رنگ‌آمیزی.. ۷۸

۳-۲-۲۸-۴- مرحله چهارم: ظاهر کردن. ۷۸

۳-۲-۲۸-۵- مرحله پنجم: توقف… ۷۹

۳-۲-۲۹- اسکن کردن ژل‌ها ۷۹

۳-۲-۳۰- نرم‌افزار Image master: 79

۳-۲-۳۰-۱- افزودن پروژه جدید. ۷۹

۳-۲-۳۰-۲- وارد کردن ژل‌ها به این پروژه ۸۱

۳-۲-۳۰-۳- نمایان ساختن spot‌ها ۸۳

۳-۲-۳۰-۴- گروه بندی کردن ژل‌ها ۸۴

۳-۲-۳۰-۴-۱- انتخاب مرجع (refrence). 85

۳-۲-۳۰-۴-۲- تهیه یک کپی از ژل مرجع.. ۸۶

۳-۲-۳۰-۴-۳- مراحل مچ کردن ژل‌ها ۸۷

۳-۲-۳۰-۵- مچ کردن بین گروهی.. ۹۳

۳-۲-۳۰-۶- گرفتن تست آماری.. ۹۵

۳-۲-۳۰-۶-۱- انتخاب تست‌های مورد قبول. ۹۶

۳-۲-۳۰-۷- بررسی تمامی نقاط انتخاب شده ۹۶

۳-۲-۳۰-۸- گزارش‌گیری نهایی.. ۹۷

۳-۲-۳۱- وارد نمودن گزارش نقاط به فایل اکسل.. ۹۸

۳-۲-۳۲- انتخاب نقاط تغییر یافته و مشخص نمودن آن‌ها روی پرینت ژل‌ها ۱۰۰

۳-۲-۳۳- برش دادن نقاط مورد نظر از ژل‌ها ۱۰۰

۳-۲-۳۴- ارسال نقاط برای طیف سنجی جرمی و شناسایی پروتئین‌های مورد نظر. ۱۰۰

فصل چهارم – تجزیه و تحلیل داده‌ها (یافته‌ها). ۱۰۱

۴-۱- میزان جذب نوری نمونه‌های Batch قبل از فاز سریع رشد. ۱۰۱

۴-۲- میزان جذب نوری نمونه‌های EnBase قبل از فاز سریع رشد. ۱۰۲

۴-۳- میزان جذب نوری نمونه‌ها شش ساعت پس از فاز سریع رشد. ۱۰۲

۴-۴- میزان جذب نوری نمونه‌ها ۲۴ ساعت پس از فاز سریع رشد. ۱۰۳

۴-۵- SDS-Page از پلت باکتری برای نمونه‌های قبل از فاز سریع رشد. ۱۰۴

۴-۶- تعیین غلظت با Brad ford. 105

۴-۷- SDS-Page از سوپ باکتری پس از افزودن TCA برای نمونه‌های قبل از فاز سریع رشد. ۱۰۶

۴-۸- SDS Page از سوپ باکتری پس از افزودن TCA برای تمامی نمونه‌های سیستم Batch. 106

۴-۹- SDS Page از سوپ باکتری پس از افزودن TCA برای تمامی نمونه‌های سیستم EnBase. 107

۴-۱۰- تصاویر اسکن شده‌ی ژل‌ها ۱۰۸

۴-۱۱- نقاط انتخاب شده از جدول اکسل.. ۱۱۱

۴-۱۱-۱- بررسی نقطه شماره ۶۰۰۵.. ۱۱۲

۴-۱۱-۲- بررسی نقطه شماره ۵۹۲۴.. ۱۱۲

۴-۱۱-۳- بررسی نقطه شماره ۴۹۲۷.. ۱۱۳

۴-۱۱-۴- بررسی نقطه شماره ۴۵۸۹.. ۱۱۴

۴-۱۲- نتایج حاصل از شناسایی توسط طیف سنجی جرمی.. ۱۱۵

۴-۱۲-۱- نقطه پروتئینی شماره ۶۰۰۵.. ۱۱۵

۴-۱۲-۲- نقطه پروتئینی شماره ۵۹۲۴.. ۱۱۸

۴-۱۲-۳- نقطه پروتئینی شماره ۴۹۲۷.. ۱۲۱

۴-۱۲-۴- نقطه پروتئینی شماره ۴۵۸۹.. ۱۲۳

فصل پنجم – نتیجه‌گیری و پیشنهادات۱۲۶

۵-۱- نقطه پروتئینی شماره ۶۰۰۵.. ۱۲۶

۵-۲- نقطه پروتئینی شماره ۵۹۲۴.. ۱۳۲

۵-۳- نقطه پروتئینی شماره ۴۹۲۷.. ۱۳۳

۵-۴- نقطه پروتئینی شماره ۴۵۸۹.. ۱۳۵

۵-۵- نتیجه‌گیری کلی و پیشنهادات: ۱۳۷

فهرست مراجع.. ۱۳۹

فهرست جداول

عنوان                                                                                                                   صفحه

جدول ‏۱‑۱- خلاصه‌ای از آنتی‌بادی‌های درمانی عرضه شده به بازار. ۳

جدول ‏۱‑۲- مخمر‌هایی که برای تولید پروتئین‌های نوترکیب استفاده می‌شوند. ۵

جدول ‏۱‑۳- سلول‌های حشرات بیان کننده پروتئین‌های نوترکیب… ۷

جدول ‏۱‑۴- سلول‌های پستانداران بیان کننده پروتئین‌های نوترکیب… ۹

جدول ‏۱‑۵- مثال‌هایی از تولید پروتئین‌های داخل سلولی در باکتری‌های گرم مثبت… ۱۱

جدول ‏۱‑۶- مثال‌هایی از تولید پروتئین‌های خارج سلولی در باکتری‌های گرم مثبت… ۱۲

جدول ‏۱‑۷- باکتری‌های گرم منفی تولید کننده پروتئین‌های نوترکیب… ۱۳

جدول ‏۱‑۸- مهم‌ترین سویه‌های E. coli مورد استفاده برای بیان پروتئین‌های نو ترکیب… ۱۵

جدول ‏۱‑۹- پروتئین‌های درمانی که اخیرا مورد تایید قرار گرفته‌اند و از E. coli به‌عنوان میزبان بیانی استفاده کرده‌اند  ۲۰

جدول ‏۱‑۱۰- برخی از مشکلات تولید پروتئین هترولوگ در E. coli و راه حل‌های ممکن.. ۳۲

جدول ‏۳‑۱- دستگاه‌های مورد نیاز برای انجام این مطالعه. ۵۰

جدول ‏۳‑۲- مواد مورد استفاده در این مطالعه. ۵۱

جدول ‏۳‑۳- ابزار استفاده شده در این مطالعه. ۵۱

جدول ‏۳‑۴- مواد لازم جهت ساخت SDS acrylamide stock solution (30% T-2. 6% C) 56

جدول ‏۳‑۵- مواد لازم جهت ساخت %۱۰ SDS. 56

جدول ‏۳‑۶- مواد لازم جهت ساخت ژل resolving. 57

جدول ‏۳‑۷- مواد لازم جهت ساخت %۱۰ Ammonium persulfate (APS) 57

جدول ‏۳‑۸- مواد لازم جهت ساخت Stacking Gel monomer solution. 57

جدول ‏۳‑۹- مقادیر نمونه و Luding 2X مورد استفاده برای تزریق به چاهک‌ها ۵۸

جدول ‏۳‑۱۰- مواد لازم جهت ساخت ۱۰X running buffer solution. 59

جدول ‏۳‑۱۱- مواد مورد نیاز جهت ساخت Tris stock solution. 60

جدول ‏۳‑۱۲- مواد مورد نیاز جهت ساخت Washing buffer (sucrose buffer) 61

جدول ‏۳‑۱۳- موارد مورد نیاز برای ساخت Lysis buffer stock solution. 61

جدول ‏۳‑۱۴- مقادیر DTT مورد نیاز برای افزودن به بافر لیز کننده ۶۲

جدول ‏۳‑۱۵- مقادیر لایزز بافر مورد استفاده برای هر نمونه. ۶۲

جدول ‏۳‑۱۶- مواد لازم جهت ساخت کوکتلی برای حذف ترکیبات اضافی.. ۶۳

جدول ‏۳‑۱۷- مواد لازم جهت ساخت Brom phenol Blue stock solution. 64

جدول ‏۳‑۱۸- مواد لازم جهت ساخت Rehydration buffer stock solution. 65

جدول ‏۳‑۱۹- مقدار DTT افزوده شده به Rehydration buffer 65

جدول ‏۳‑۲۰- مواد لازم جهت ساخت Bradford reagent 65

جدول ‏۳‑۲۱- مقادیر نمونه و Luding 2X و Luding 1X مورد استفاده برای تزریق به چاهک‌ها ۶۷

جدول ‏۳‑۲۲- مقادیر نمونه و بافر رهیدراسیون مصرفی برای بعد اول الکتروفورز. ۶۸

جدول ‏۳‑۲۳- مواد مورد نیاز جهت ساخت ژل‌های ۱۲% و ۱۵%. ۷۲

جدول ‏۳‑۲۴- مواد مورد نیاز جهت ساخت Water-saturated n-butanol 73

جدول ‏۳‑۲۵- مواد مورد نیاز جهت ساخت Gel storage solution. 73

جدول ‏۳‑۲۶- مواد مورد نیاز جهت ساخت Equilibratio based buffer 74

جدول ‏۳‑۲۷- مواد مورد نیاز جهت ساخت Equilibratio buffer 1. 75

جدول ‏۳‑۲۸- مواد مورد نیاز برای ساخت Equilibratio buffer 2. 75

جدول ‏۳‑۲۹- مواد لازم جهت ساخت Agarose sealing solution. 75

جدول ‏۳‑۳۰- مواد لازم جهت ساخت Fixation solution. 77

جدول ‏۳‑۳۱- مواد لازم جهت ساخت Washing solution. 77

جدول ‏۳‑۳۲- مواد لازم جهت ساخت Sensitizing solution. 78

جدول ‏۳‑۳۳- مواد لازم جهت ساخت Staining solution. 78

جدول ‏۳‑۳۴- مواد لازم جهت ساخت Developing solution. 78

جدول ‏۳‑۳۵- مواد لازم جهت ساخت Stoping solution. 79

جدول ‏۳‑۳۶- اطلاعات نقاط پروتئینی بدست آمده از نرم‌افزار Image Master (فایل Excel). 99

جدول ‏۴‑۱- میزان جذب نوری نمونه‌های Batch قبل از فاز سریع رشد. ۱۰۱

جدول ‏۴‑۲- میزان جذب نوری نمونه‌های EnBase قبل از فاز سریع رشد. ۱۰۲

جدول ‏۴‑۳- میزان جذب نوری نمونه‌های Batch و EnBase شش ساعت پس از فاز سریع رشد. ۱۰۲

جدول ‏۴‑۴- میزان جذب نوری نمونه‌های Batch و EnBase 24 ساعت پس از فاز سریع رشد. ۱۰۳

جدول ‏۴‑۵- مقادیر جذب نوری با استفاده از Brad ford برای تمامی نمونه‌ها ۱۰۵

جدول ‏۴‑۶- نقاط منتخب و اطلاعات آن‌ها ۱۱۱

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                   صفحه

شکل ‏۱‑۱- میزان فروش داروهای نوترکیب که در میزبان E. coli تولید می‌شوند. ۴

شکل ‏۱‑۲- توزیع فراوانی بیان پروتئین‌های نوترکیب را در میزبان‌های بیانی مختلف… ۵

شکل ‏۱‑۳- مزایای استفاده از باکتری E. coli برای بیان پروتئین‌های نوترکیب… ۲۸

شکل ‏۳‑۱- نحوه بستن شسشه‌ها جهت ریختن ژل SDS Page. 56

شکل ‏۳‑۲- مراحل آماده سازی ژل‌ها برای تزریق نمونه. ۵۹

شکل ‏۳‑۳- تزریق نمونه‌ها به چاهک‌های موجود روی ژل. ۶۰

شکل ‏۳‑۴- دستگاه سونیکه. ۶۳

شکل ‏۳‑۵- دستگاه اسپکتوفتومتر. ۶۶

شکل ‏۳‑۶- tray ساده ۶۹

شکل ‏۳‑۷- tray قطب دار. ۷۰

شکل ‏۳‑۸- دستگاه IEF. 71

شکل ‏۳‑۹- شیشه و نوارهای مخصوص ژل‌های ۱۷ سانتی‌متری.. ۷۱

شکل ‏۳‑۱۰- نمایی از ریختن ژل گرادیان. ۷۳

شکل ‏۳‑۱۱- نحوه افزودن پروژه جدید. ۸۰

شکل ‏۳‑۱۲- نحوه وارد کردن نام و مکان ذخیره پروژه ۸۰

شکل ‏۳‑۱۳- موارد مشاهده شده در قسمت پروژه جدید. ۸۱

شکل ‏۳‑۱۴- نحوه import کردن ژل‌ها به پروژه ۸۱

شکل ‏۳‑۱۵- انتخاب فرمت ژل‌ها ۸۲

شکل ‏۳‑۱۶- انتخاب نام و نوع رنگ‌آمیزی ژل‌ها ۸۲

شکل ‏۳‑۱۷- گزینه gels بعد از وارد کردن ژل‌ها ۸۲

شکل ‏۳‑۱۸- باز کردن تصویر ژل. ۸۳

شکل ‏۳‑۱۹- نحوه Detect کردن ژل‌ها ۸۳

شکل ‏۳‑۲۰- انتخاب میزان حساسیت Detect کردن ژل‌ها ۸۴

شکل ‏۳‑۲۱- قسمتی از یک ژل Detect شده ۸۴

شکل ‏۳‑۲۲- گروه بندی کردن ژل‌ها ۸۵

شکل ‏۳‑۲۳- انتخاب مرجع برای هر گروه از ژل‌ها ۸۶

شکل ‏۳‑۲۴- نمایی از سه ژل که یکی از آن‌ها مرجع قرار داده شده‌است… ۸۶

شکل ‏۳‑۲۵- تصویری از ژل‌ها به همراه کپی ژل مرجع.. ۸۷

شکل ‏۳‑۲۶- انتخاب یک نقطه mark شده به منظور مچ شدن بهتر ژل‌ها ۸۸

شکل ‏۳‑۲۷- فلش نشان دهنده‌ی نقاط Land mark می‌باشد. ۸۸

شکل ‏۳‑۲۸- نحوه مچ کردن ژل‌ها با هم توسط نرم‌افزار. ۸۸

شکل ‏۳‑۲۹- انتخاب نحوه نمایش نقاط روی ژل‌ها ۸۹

شکل ‏۳‑۳۰- نحوه نمایش تمام نقاط روی ژل‌ها ۸۹

شکل ‏۳‑۳۱- نمایش کل نقاط روی ژل‌ها ۹۰

شکل ‏۳‑۳۲- نحوه افزودن یک نقطه مچ شده جدید. ۹۰

شکل ‏۳‑۳۳- نمایش شکل سه بعدی نقاط.. ۹۱

شکل ‏۳‑۳۴- نحوه حذف یک نقطه مچ شده از روی ژل‌ها ۹۱

شکل ‏۳‑۳۵- نحوه جدا کردن نقاطی که روی هم افتاده اند. ۹۲

شکل ‏۳‑۳۶- نمایش سه بعدی نقاط جدا شده ۹۲

شکل ‏۳‑۳۷- نحوه افزودن یک نقطه به ژل. ۹۳

شکل ‏۳‑۳۸- نحوه‌ی ساخت کلاس جدید. ۹۴

شکل ‏۳‑۳۹- کپی کردن تصاویر ژل‌ها در کلاس ایجاد شده ۹۴

شکل ‏۳‑۴۰- تصاویر تمامی ژل‌ها در یک کلاس… ۹۵

شکل ‏۳‑۴۱- نحوه‌ی گرفتن تست آماری.. ۹۵

شکل ‏۳‑۴۲- انتخاب نوع تست آماری مورد نظر. ۹۵

شکل ‏۳‑۴۳- جدول تست آماری.. ۹۶

شکل ‏۳‑۴۴- انتخاب نقاط با تست بالای ۷۷۸/۲.. ۹۶

شکل ‏۳‑۴۵- نحوه‌ی نمایش نقطه روی ژل‌ها ۹۷

شکل ‏۳‑۴۶- نمایش نقطه مورد نظر روی ژل‌ها ۹۷

شکل ‏۳‑۴۷- نحوه‌ی یافتن نقطه از طریق Match ID.. 97

شکل ‏۳‑۴۸- وارد نمودن ID نقطه مورد نظر. ۹۸

شکل ‏۳‑۴۹- نحوه‌ی گزارش‌گیری.. ۹۸

شکل ‏۳‑۵۰- گزارش نقطه مورد نظر روی تمام ژل‌ها ۹۸

شکل ‏۳‑۵۱- انتخاب نقاط تغییر یافته و مشخص نمودن آن‌ها روی پرینت ژل‌ها ۱۰۰

شکل ‏۴‑۱- SDS-Page از پلت باکتری.. ۱۰۵

شکل ‏۴‑۲- SDS-Page از سوپ باکتری پس از افزودن TCA.. 106

شکل ‏۴‑۳- SDS-Page از سوپ باکتری پس از افزودن TCA برای تمامی نمونه‌های Batch. 107

شکل ‏۴‑۴- Page از سوپ باکتری پس از افزودن TCA برای تمامی نمونه‌های EnBase. 108

شکل ‏۴‑۵- تصویر اسکن شده ژل Batch 1. 108

شکل ‏۴‑۶- تصویر اسکن شده ژل Batch 2. 109

شکل ‏۴‑۷- تصویر اسکن شده ژل Batch 3. 109

شکل ‏۴‑۸- تصویر اسکن شده ژل EnBase 1. 110

شکل ‏۴‑۹- تصویر اسکن شده ژل EnBase 2. 110

شکل ‏۴‑۱۰- تصویر اسکن شده ژل EnBase 3. 111

شکل ‏۴‑۱۱- موقعیت نقطه پروتئینی شماره ۶۰۰۵ روی تمامی ژل‌ها ۱۱۲

شکل ‏۴‑۱۲- موقعیت نقطه پروتئینی شماره ۵۹۲۴ روی تمامی ژل‌ها ۱۱۳

شکل ‏۴‑۱۳- موقعیت نقطه پروتئینی شماره ۴۹۲۷ روی تمامی ژل‌ها ۱۱۴

شکل ‏۴‑۱۴- موقعیت نقطه پروتئینی شماره ۴۵۸۹ روی تمامی ژل‌ها ۱۱۵

شکل ‏۴‑۱۵- چرخه متابولیسم کربن و نیتروژن. ۱۱۶

شکل ‏۴‑۱۶- مسیر تخریب آرژنین.. ۱۲۰

شکل ‏۴‑۱۷- مراحل بیوسنتز آرژنین.. ۱۲۳

فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                   صفحه

نمودار ‏۴‑۱- نمودار تغییرات OD برحسب زمان برای تمامی نمونه‌ها ۱۰۴

نمودار ‏۴‑۲- نمودار هیستوگرام نقطه پروتئینی شماره ۶۰۰۵.. ۱۱۲

نمودار ‏۴‑۳- نمودار هیستوگرام نقطه پروتئینی شماره ۵۹۲۴.. ۱۱۳

نمودار ‏۴‑۴- نمودار هیستوگرام نقطه پروتئینی شماره ۴۹۲۷.. ۱۱۴

نمودار ‏۴‑۵- نمودار هیستوگرام نقطه پروتئینی شماره ۴۵۸۹.. ۱۱۵

نقد و بررسی‌ها

هیچ دیدگاهی برای این محصول نوشته نشده است.

اولین کسی باشید که دیدگاهی می نویسد “بررسی تغییرات پروفایل پروتئومیکس در دو روش کشت Batch، Fed- batch در باکتری E. coli بیان کننده Fab Fragment ضد VEGF قبل از شروع فاز سریع رشد”
قبلا حساب کاربری ایجاد کرده اید؟
گذرواژه خود را فراموش کرده اید؟
Loading...