%53تخفیف
بررسی تغییرات پروفایل پروتئومیکس در دو روش کشت Batch، Fed- batch در باکتری E. coli بیان کننده Fab Fragment ضد VEGF قبل از شروع فاز سریع رشد
تعداد 174 صفحه در فایل word
عنوان:
مقدمه: امروزه تولید پروتئینهای نوترکیب خصوصا آنتیبادیهای مونوکلنال به منظور تشخیص و درمان بیماریها از چالشهای اساسی در صنایع بزرگ دارویی میباشد. به همین منظور رسیدن به سطح بیان بالا در پروسههای صنعتی بسیار حائز اهمیت است. این سطح بیان بالا باید با تاخوردگی و تغییرات پس ترجمهای مناسب و همچنین قابلیت تولید در مقیاس بالا همراه باشد. امروزه بخش عمده محصولات نوترکیب در صنایع دارویی در دو میزبان سلولهای پستانداران و باکتری اشریشیا کلای تولید میشوند.
-
coli با ژنتیک شناخته شده، رشد سریع، محیط کشت ساده و ارزان، زمان کشت کوتاه، Scale up آسان برای فرمانتاسیون و توانایی تولید پروتئینهای غیر گلیکوزیله خصوصا قطعات آنتیبادی Fab و ScFv ، یکی از مهمترین و پرکاربردترین میزبانهای بیانی محسوب میشود. بیان پروتئین درE. coli محدودیتهایی چون ناتوانی در تشکیل تغییرات پس از ترجمه، ناکارآمدی در بلوغ پروتئین ها بواسطه پروتئولیز و پیوند دیسولفیدی را به همراه دارد.
راهکارهای متفاوتی برای بهبود Folding پروتئین در E. coli وجود دارد که یکی از مهمترین آنها اصلاحات در سیستم کشت است. استفاده از محیط Fed-batch نسبت به کشت سنتی Batch، منجر به دانسیته سلولی بالا به همراه بازده بیشتر پروتئین نوترکیب میشود. در سیستم Fed-batch به دلیل رشد کنترل شده، PH در تمام مدت کشت در سطح دلخواه باقی مانده و تجمع استات و سایر متابولیتهای مضر نیز به حداقل میرسد و از بروز شرایط بیهوازی جلوگیری میشود. محیط Fed-Batch مورد استفاده در این پایان نامه EnBase میباشد که در آن فعالیت آنزیماتیک گلوکز بین نمکهای معدنی و سایر ترکیبات تعادل ایجاد کرده و منجر به تولید بیشتر پروتئین به فرم محلول میشود.
نمونهی مورد مطالعه در این پایان نامه، قطعه Anti-VEGF برای درمان بیماری چشمی AMD، بیان شده در E. coli BL21 است که محیط احیای سیتوپلاسم آن به محیط اکسیداتیو تبدیل شدهاست. با استفاده از پروتئومیکس کلیه پروتئینهای بیان شده توسط E. coli بر روی ژل 2DE تفکیک شده و میزان بیان پروتئین ها در دو محیط Batch و EnBase مشاهده شدند. سپس تمام نقاط پروتئینی موجود روی تصاویرژل ها توسط نرم افزار Image master بررسی شده و نقاط منتخب با استفاده از طیف سنجی جرمی پروتئین ها تعیین هویت میشوند و میتوان متوجه شد که میزان بیان چه پروتئینهایی در کشت EnBase نسبت به Batch تغییر کردهاست. در صورت شناخت دقیقتر پروتئینهای کلیدی دخیل در مسیر بیان و رشد سلول قادر به دستورزی هدفمند ژنهای کد کننده این پروتئینها و در نتیجه رسیدن به پروفایل رشد و بیان مناسب قطعه آنتیبادی مورد نظر خواهیم بود.
نتایج: با بررسی تغییرات پروفایل پروتئومیکس در دو روش کشت EnBase و Batch قبل از شروع فاز سریع رشد، چهار پروتئین با تغییر در میزان regulation شناسایی شدند. نقطه پروتئینی شماره 6005 مربوط به پروتئین maeA Malic enzyme, NAD-dependent، نقطه شماره 5924 مربوط به پروتئین astC Succinylornithine transaminase و نقطه 4927 مربوط به پروتئین argD Acetylornithine aminotransferase که در روش کشت EnBase نسبت به Batch، up regulate شدند و نقطه شماره 4589 مربوط به پروتئین malS alpha-Amylase, periplasmic که تنها در روش کشت Batch بیان شده و در سیستم EnBase وجود نداشت. آنزیم مالیک (ME)، دکربوکسیلاسیون اکسیداتیو L-malate به پیروات و CO2 را با کاهش کوفاکتور NADP+ در حضور کاتیون دو ظرفیتیMn2+ در چرخه کربس، کاتالیز میکند. up regulation این آنزیم نشاندهنده فعالیت بالای چرخه کربس در محیط EnBase نسبت به محیط Batch است و متعاقب آن در محیط EnBase نسبت به محیط Batch دانسیته سلولی بالاتری را مشاهده میکنیم. Succinylornithine transaminase در کاتابولیسم آرژنین و پرولین شرکت میکند. در محیط EnBase دانسیته سلولی به شدت افزایش مییابد و درنتیجه نیاز به منبع نیتروژن نیز افزایش مییابد.
Acetylornithine aminotransferase در چرخهی اوره و در متابولیسم گروههای آمینو دخالت میکند و مراحل آمیناسیون را در بیوسنتز لایزین، ارنیتین و آرژنین، کاتالیز میکند. Up regulation آنزیم Acetylornithine aminotransferase در محیط EnBase نسبت به محیط Batch، نشاندهنده دانسیته سلولی بالا و نیاز سلولها به سنتز اسیدهای آمینه جهت استفاده بهعنوان منبع نیتروژن است.
آلفا آمیلاز پریپلاسمیک اشریشیاکلای، مالتودکسترینهای خطی را هیدرولیز میکند. در محیط Batch بهدلیل وجود کنترل نشده و فراوان مواد غذایی، بیان این پروتئین به شدت افزایش داشته تا بتواند مواد نشاستهای موجود در محیط را شکسته و در اختیار باکتریها قرار دهد. این آنزیم در فاز پیش از القا در محیط EnBase اصلا بیان نشدهاست که این میتواند بهدلیل انتشار آهسته و نبود مواد نشاستهای فراوان در ابتدای کشت باشد.
بحث: با توجه به نقش کلیدی پروتئینهای تعیین هویت شده، میتوان نتیجه گرفت که بیشترین افزایش تنظیم در سطح پروتئینهایی صورت گرفته که عملکرد آنها منجر به تولید انرژی و بیوسنتز و کاتابولیسم اسیدهای آمینه بهعنوان منبع نیتروژن است. بنابراین با دستورزی ژنتیکی این پروتئینهای درون سلولی، شاید بتوان بیان پروتئین محلول را افزایش داد. همانطور که قبلا نیز ذکر شد، تولید پروتئین به فرم محلول هدف اصلی بیان این پروتئینها در سیستم بیانی E. coli میباشد. با افزایش بیان پروتئینهای درون سلولی دخیل در تولید انرژی و منبع نیتروژن، میتوان به دانسیته سلولی بالاتر و درنتیجه تولید پروتئینهای نوترکیب به فرم محلول دست یافت.
1 دیدگاه برای بررسی تغییرات پروفایل پروتئومیکس در دو روش کشت Batch، Fed- batch در باکتری E. coli بیان کننده Fab Fragment ضد VEGF قبل از شروع فاز سریع رشد
دیدگاه خود را بنویسید لغو پاسخ
marax sans ordonnance en Espagner –
Thanks, this website is really handy. Bestellung von Medikamenten in Belgien online