ژنوتایپینگ توکسوپلاسماگوندی در گربه¬های ولگرد و رت¬های وحشیِ شهر تهران، با استفاده از ژن GRA6

فهرست مطالب

فصل اول: مقدمه و کلیات تحقیق………………… 1

1-1. سرآغاز و چشم­انداز تاریخی توکسوپلاسماگوندی…. 2

1-2. مورفولوژی و چرخه زندگی تک­یاخته توکسوپلاسماگوندی 8

1-2-1. تاکی­زوئیت……………………………… 10

1-2-2. برادی­زوئیت­ها و کیست­های نسجی……………… 12

1-2-3. چرخه زندگی در میزبان نهایی، گربه (مرحله روده­ای یا ایزوسپوری)……………………………………………. 15

1-2-4. چرخه زندگی در میزبانان واسط (مرحله خارج روده­ای) 17

1-3. بیولوژی مولکولی………………………. 18

1-3-1. ژنوم توکسوپلاسماگوندی……………………. 18

1-3-2. آنتی­ژن­های توکسوپلاسماگوندی……………….. 21

1-4. انتقال………………………………. 27

1-4-1. انتقال توسط اووسیست­ها…………………… 27

1-4-1-1. گربه­ها همه­جا حضور دارند……………………. 27

1-4-1-2. دفع اووسیست توسط گربه­های خانگی آلوده………… 27

1-4-1-3. دفع مکرر اووسیست­ها………………………… 28

1-4-1-4. دفع اووسیست­ها توسط گربه­سانانِ وحشیِ آلوده……… 29

1-4-1-5. پراکندگی اووسیست­ها در محیط زیست…………….. 30

1-4-1-6. مقاومت اووسیست­ها در محیط زیست………………. 31

1-4-2. انتقال توسط کیست­های نسجی………………… 31

1-4-3. انتقال توسط تاکی­زوئیت­ها…………………. 33

1-5. اپیدمیولوژی………………………….. 34

1-6. روابط میزبان- انگل……………………. 38

1-6-1. علایم بالینی در انسان……………………. 42

1-6-1-1. توکسوپلاسموزیس اکتسابی اولیه پس از تولد………. 42

1-6-1-2. توکسوپلاسموزیس چشمی………………………… 43

1-6-1-3. توکسوپلاسموزیس در افراد دچار نقص ایمنی……….. 43

1-6-1-4. توکسوپلاسموزیس مادرزادی…………………….. 44

1-7. تشخیص……………………………….. 45

1-7-1. روش­های مولکولی…………………………. 47

1-7-1-1. واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)……………….. 47

1-7-1-2. مواد مورد نیاز انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز….. 48

1-7-1-3. مراحل انجام سیکل حرارتی……………………. 50

1-7-1-4. Nested PCR…………………………………. 51

1-8. ایمنی حفاظتی…………………………. 52

1-9. درمان……………………………….. 52

1-10. پیشگیری و کنترل……………………… 53

1-11. توکسوپلاسموزیس در گربه­سانان……………. 55

1-11-1. شیوع در گربه­سانان……………………… 55

1-11-2. علایم بالینی و راه­های تشخیص……………… 56

1-12. توکسوپلاسموزیس در جوندگان و پستانداران کوچک 58

1-13. آنالیز فیلوژنتیک…………………….. 60

1-13-1. اطلاعات مورد استفاده در فیلوژنی مولکولی…… 60

1-13-2. مفهوم درخت فیلوژنتیک…………………… 62

1-13-3. آماده­سازی داده­ها………………………. 64

1-13-3-1. بانک­های اطلاعاتی عمومی توالی اسیدنوکلئیک…….. 64

1-13-3-2. نام ثبت شده، شناسنامه یا نام لوکوس…………. 65

1-13-3-3. شماره دست­یابی……………………………. 65

1-13-3-4. شماره نگارش……………………………… 65

1-13-4. جستجو در بانک­های اطلاعاتی به­وسیله تشابه توالی 66

1-13-4-1. هم­ترازی بهینه……………………………. 66

1-13-4-2. ابزار جستجوی هم­ترازی موضعی پایه (BLAST)…….. 66

1-13-4-3. هم­ترازی توالی چندگانه…………………….. 66

1-13-4-4. هم­ترازی پیشرفته………………………….. 67

1-13-4-5. CLUSTAL…………………………………. 67

1-13-5. ارزیابی اعتبار درخت فیلوژنتیک…………… 67

فصل دوم: مروری بر مطالعات پیشین…………….. 69

2-1. مطالعات پیشین………………………… 70

2-1-1. مطالعات پیشین در جهان…………………… 70

.2-1-2. مطالعات پیشین در ایران…………………. 76

فصل سوم: مواد و روش­ها……………………… 80

3-1. مواد لازم…………………………….. 81

3-1-1. محلول­ها و بافرها……………………….. 81

3-1-1-1. محلول نمکِ فسفات با خاصیت بافری (بافر فسفات­سالین) 81

3-1-1-2. SDS 10%…………………………………… 81

3-1-1-3. NaCL 6M…………………………………… 81

3-1-1-4. پروتئیناز K………………………………. 82

3-1-1-5. بافر الکتروفورز (TAE 10X)……………………. 82

3-1-1-6. رقیق کردن بافر X10  TAEجهت تهیه بافر X1 برای الکتروفورز   82

3-1-1-7. رقیق کردن آغازگر(تهیه آغازگر استوک Pmol/UL100)… 82

3-1-1-8. رقیق کردن آغازگر استوک برای استفاده…………. 82

3-1-1-9. سایر مواد………………………………… 83

3-2. روش کار……………………………… 83

3-2-1. نمونه­های مورد مطالعه و روش نمونه­برداری……. 83

3-2-2. آماده­سازی نمونه­ها………………………. 83

3-2-2-1. آماده­سازی نمونه­ها جهت استخراج DNA…………… 84

3-2-3. استخراج DNA……………………………. 85

3-2-3-1. روش استخراج DNA از بافت مغز به روش دستی فنل- کلروفرم     85

3-2-3-2. ارزیابی کیفیت DNA…………………………. 87

3-2-3-3. شرایط نگه­داری DNA…………………………. 88

3-2-4. واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)…………….. 88

3-2-4-1. آغازگر…………………………………… 88

3-2-4-2. DNA الگو…………………………………. 89

3-2-4-3. ddH2O……………………………………. 89

3-2-4-4. مراحل PCR………………………………… 89

3-2-5. آشکارسازی و آنالیز محصولات PCR……………. 91

3-2-5-1. روش تهیه ژل آگارز…………………………. 91

3-2-5-2. بارگذاری نمونه روی ژل……………………… 92

3-2-5-3. نحوه تنظیم دستگاه الکتروفورز……………….. 92

3-2-6. مرحله RFLP……………………………… 93

3-2-6-1. آشکارسازی و آنالیز محصولات RFLP……………… 94

3-2-7. خالص­سازی محصولات PCR جهت تعیین توالی………. 94

3-2-8. آنالیزهای پس از استخراج ژن  GRA6………….. 96

3-2-8-1. تعیین توالی ژن  GRA6نمونه­ها…………………. 96

3-2-8-2. تعیین هم­ترازی توالی­های ژن  GRA6…………….. 96

3-2-8-3. ترسیم درخت فیلوژنتیک توالی­ها……………….. 96

فصل چهارم: نتایج و یافته­ها…………………. 97

4-1. نمونه­گیری……………………………. 98

4-2. استخراج DNA ژنومی…………………….. 99

4-3. Nested-PCR…………………………….. 100

4-4. RFLP………………………………… 106

4-5. تعیین توالی…………………………. 109

4-6. هم­ترازی چندگانه……………………… 112

4-6-1. نتایج حاصل از هم­ترازی چندگانه توالی­های توکسوپلاسماگوندی در دو میزبان گربه و رت…………………………….. 115

4-6-2. نتایج حاصل از هم­ترازی چندگانه ایزوله­ها با نمونه­های موجود در بانک ژن…………………………………….. 116

4-7. ترسیم درخت فیلوژنی…………………… 118

فصل پنجم: بحث، نتیجه­گیری و پیشنهادها……….. 125

5-1. بحث………………………………… 126

5-2. نتیجه­گیری…………………………… 137

5-3. پیشنهادها…………………………… 137

فهرست منابع و مراجع………………………. 138

چکیده انگلیسی……………………………. 147

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست جداول

 

جدول 1-1. خلاصه وقایع مهم تاریخی توکسوپلاسماگوندی.. 3

جدول 1-2. تاکسونومی تک­یاخته…………………. 8

جدول 1-3. استرین­های معمول توکسوپلاسماگوندی برای تحقیقات   23

جدول 1-4. مقایسه طرح­های تعیین ژنوتیپ­ها در موارد آتیپیک   24

جدول 1-5. خصوصیات ژنتیکی معمول برای تعیین استرین­های توکسوپلاسماگوندی…………………………… 25

جدول 3-1. مشخصات آغازگرهای اولیه و ثانویه……. 87

جدول 3-2. مقادیر مورد نیاز برای PCR اولیه…….. 89

جدول 3-3. مقادیر مورد نیاز برای PCR ثانویه……. 89

جدول 3-4. برنامه دستگاه ترموسایکلر جهت انجام PCR اولیه و ثانویه………………………………………… 90

جدول 3-5. مشخصات آنزیم…………………….. 92

جدول 3- 6. مقادیر مورد نیاز برای یک واکنش RFLP… 92

جدول4-1. درصد آلودگی توکسوپلاسماگوندی در گربه­های ولگرد تهران بر حسب نوع بافت…………………………….. 101

جدول4-2. آلودگی توکسوپلاسماگوندی در گربه­های ولگرد تهران بر حسب نوع بافت………………………………… 102

جدول4-3. درصد آلودگی توکسوپلاسماگوندی در رت­ها بر اساس نوع بافت 103

جدول 4-4. مقایسه  قلب رت­هایی که از مغز آن­ها DNA توکسوپلاسماگوندی جدا شده به همراه نتایج RFLP………………… 104

جدول 4-5. مشخصات قطعات برش خورده توسط آنزیم  MseIدر ژنوتیپ­های مختلف…………………………………… 105

جدول 4-6. نتایج RFLP ایزوله­های گربه و رت…….. 105

جدول 4-7. مقایسه نتایج توالی ایزوله­های گربه و رت با نمونه­های موجود در بانک ژن…………………………. 108

جدول 4-8. بازهای متغیر و جایگاه آن­ها در توالی توکسوپلاسماگوندی گربه و رت……………………………….. 111

جدول 4-9. هم­ترازی دو به دو توالی­های شناسایی شده از گربه و رت 112

                   فهرست شکل­ها    

شکل 1-1. چرخه زندگی توکسوپلاسماگوندی………….. 9

شکل 1-2. ساختار تاکی­زوئیت توکسوپلاسماگوندی……. 10

شکل 1-3. مرحله انترواپیتلیال چرخه زندگی توکسوپلاسماگوندی  15

شکل 4-1. تصویر اسپکتوفتومتر نانودراپ محصول استخراج DNA   98

شکل 4-2. ژل 1 درصد رنگ­آمیزی شده با Safe stain ایزوله­های توکسوپلاسما در گربه…………………………………. 100

شکل 4-3. ژل 1 درصد رنگ­آمیزی شده با Safe stain ایزوله­های توکسوپلاسما در رت…………………………………… 103

شکل 4-4. ژل 3 درصد رنگ­آمیزی شده با  Safe stainمحصولات RFLP ایزوله­های گربه……………………………………. 106

شکل 4-5. ژل 3 درصد رنگ­آمیزی شده با  Safe stainمحصولات RFLP ایزوله­های رت……………………………………….. 106

شکل 4-6. درخت فیلوژنی ایزوله­های توکسوپلاسما در گربه و رت  117

شکل 4-7. درخت فیلوژنی ژنوتیپ­های شناخته شده به همراه ایزوله­های گربه……………………………………. 118

شکل 4-8. درخت فیلوژنی ژنوتیپ­های شناخته شده به همراه ایزوله­های رت……………………………………….. 119

شکل 4-9. درخت فیلوژنی ژنوتیپ­های شناخته شده به همراه مقایسه ایزوله­های گربه و رت………………………. 120

شکل 4-10. درخت فیلوژنی انواع میزبان­های مطالعه شده در سطح جهان که توالی آن­ها در بانک ژنی ثبت شده است به همراه ایزوله­های توکسوپلاسما در گربه…………………………………. 121

شکل 4-11. درخت فیلوژنی انواع میزبان­های مطالعه شده در سطح جهان که توالی آن­ها در بانک ژنی ثبت شده است به همراه ایزوله­های توکسوپلاسما در رت…………………………………… 122

شکل 4-12. درخت فیلوژنی انواع میزبان­های مطالعه شده در سطح جهان که توالی آن­ها در بانک ژنی ثبت شده است به همراه مقایسه ایزوله­های توکسوپلاسما در گربه و رت…………………… 123