%53تخفیف

طراحی سنجش سریع برای anti HBc-IgM در سرم افراد آلوده به هپاتیتB

طراحی سنجش سریع برای anti HBc-IgM در سرم افراد آلوده به هپاتیتB

تعداد 111صفحه در فایل word

چکیده

طراحی سنجش سریع برای anti-HBc IgM در سرم افراد آلوده به هپاتیت B

مقدمه و هدف: هپاتیت یکی از علل عمده مرگ و میر در جهان است. HBc یکی از پروتئینهای هپاتیت B میباشد، که یک پروتئین ایمونوژن قوی است. تا کنون در تشخیص هپاتیت روشهای مختلفی مورد بررسی قرار گرفته است. در این مطالعه هدف ما با استفاده از این پروتئین طراحی یک سنجش سریع به منظور غربالگری سریع و آسان نمونههای سرمی از نظر IgM anti-HBc بود که یکی از مارکرهای سرولوژیک عفونت حاد با ویروس HBV میباشد.

روشکار: بدین منظور توالی کد کننده HBc ژنوتایپ D از بانک اطلاعاتی Uniprot استخراج و بر حسب استفاده کدونی در E. coli بهینه سازی شد و در وکتور pET22b بین جایگاه BamHI و ECORI ساب کلون گردید. وکتور نوترکیب حاصل در سلولهای BL21 که به صورت شیمیایی مستعدسازی شده بود ترانسفورم گردید. بیان پروتئین HBc با افزودن IPTG القا شد. HBc با استفاده از روش شوک اسمزی و ستون نیکل تخلیص و حساسیت و اختصاصیت با روش الایزا مورد بررسی قرار گرفت. HBc با استفاده از نانو ذرات طلا نشاندار شد و به عنوان آنتیژن کونژوگه در بخش ایمونوکروماتوگرافی مورد استفاده قرار گرفت.

نتایج: نتایج SDS PAGE نشان داد که HBc با موفقیت در سلولهای E. coli بیان شده است. نتایج حاصل ازSDS PAGE نشان میدهد که پروتئین با استفاده از دو روش فوق با خلوص بیش از 90 درصد تخلیص شده است. بررسیهای حاصل از الایزا و سنجش ایمونوکروماتوگرافی و مقایسه با روشهای تجاری نشان میدهد که HBc تولید شده حساسیت و اختصاصیت کافی را دارا است.

نتیجهگیری: بیان HBcبا استفاده از روش پریپلاسمی یک روش مفید و ساده برای تهیه آسان این آنتیژن است و نتایج الایزا و ایمونوکروماتوگرافی تایید کننده حساسیت و اختصاصیت است.

واژگان کلیدی: بیان پروتئین، تخلیص، هپاتیتB ، آنتیژن مرکزی، E. coli

دسته: زیست شناسی, علوم تجربی برچسب: E. coli, آنتیژن مرکزی, تخلیص, هپاتیتB, واژگان کلیدی: بیان پروتئین

توضیحات

فهرست مطالب

عنوان صفحه

1مقدمه. 2

1-1 ویروس… 2

1-2 هپادنا ویریده 2

1-2-1 گروه بندی هپادنا ویریده 3

1-2-2 هپاتیت B.. 4

1-2-3 ساختار و ژنوم HBV… 6

1-2-4 ژن های HBV… 7

1-2-4 پروتئین های ویروس HBV… 8

1-2-4-1……………………………………………………………………………………………………………………………. HBc و HBe. 8

1-2-4-2 پروتئین سطحی HBs. 10

1-2-5 چرخه همانند سازی.. 11

1-2-6 بیماریزایی.. 12

1-2-6-1……………………………………………………………………………………………………………………….. بیماریزایی HBV.. 12

1-2-6-2…………………………………………………………………………………………………………………… بيماريزايي مولکولي.. 14

1-2-7 اپیدمیولوژیHBV… 15

1-2-7-1………………………………………………………………………………………………………………… اپیدمیولوژی در جهان. 15

1-2-7-2…………………………………………………………………………………………………………………. اپیدمیولوژی در ایران. 17

1-2-8 نحوه انتقال HBV… 17

1-2-9 تشخیص….. 17

1-2-9-1……………………………………………………………………………………………………………….. تست های بیوشیمیایی.. 18

1-2-9-1-1 آنزیم های کبدی.. 18

1-2-9-1-2 الایزا 18

1-2-9-1-3 واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) 18

1-2-9-1-4 وسترن بلات… 19

1-2-9-2………………………………………………………………………………………………………………….. تست ها سرولوژیکی.. 19

1-2-9-2-1 آنتی ژن سطحی هپاتیت B (HBsAg ) 19

1-2-9-2-2 آنتی ژن مرکزی هپاتیت B ( HBcAg ) 20

1-2-9-2-3 آنتی ژن e هپاتیت B ( HBeAg ) 20

1-2-9-2-4 آنتی بادی بر علیه HBsAg ( Anti-HBs ) 20

1-2-9-2-5 آنتی بادی بر علیه HBcAg ( Anti-HBc ) 20

1-2-9-2-6 آنتی بادی بر علیه HBeAg ( Anti-HBe ) 21

1-2-10………………………………………………………………………………………………………………………………. طراحی پروتئین.. 23

1-2-10-1طراحی ژن. 23

1-2-11………………………………………………………………………………………………………………. عوامل موثر در طراحی ژن. 23

1-2-11-1محتوای CG.. 23

1-2-11-2کدون های نادر. 23

1-2-11-3شاخص سازگاری کدونی.. 23

1-2-12…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. وکتور. 24

1-2-13……………………………………………………………………………………………………………………… بیان در پروکاریوت ها 24

1-2-14………………………………………………………………………………………………………………………….. سنجش های سریع. 25

1-2-14-1معرفی.. 25

1-2-14-2ساختار. 25

1-2-14-3آنتیبادی.. 26

1-2-14-4غشاء. 26

1-2-14-5خط تست… 27

1-2-14-6پد نمونه و پد کونژوگه. 27

1-2-14-7 پد جاذب… 28

1-2-14-8نشانه. 28

1-2-14-9طراحی سنجش سریع. 29

2 مروری بر مطالعات… 31

2-2 در این فصل به بررسی مطالعات انجام شده و نتایج آنها تاکنون در رابطه با هپاتیت پرداخته شده است. 31

2-مواد و روش… 41

3-1 لیست مواد مورد استفاده و نام شرکتهایی که مواد از آنها تهیه شده است. 41

3-2 لیست دستگاههای مورد استفاده و نام شرکتها یا کارخانه‌های سازنده آن ها 43

3-3 وسایل.. 44

3-4 محيط کشت‌های باکتري.. 44

3-5 استوک آنتیبیوتیک… 44

3-6 بافرها 45

3-6-1 بافرهای ترانسفورماسیون شیمیایی.. 45

3-6-2 بافرهای الکتروفورز DNA… 45

3-6-3 بافرهای بیان پروتئین.. 45

3-6-4 بافرهای SDS – PAGE.. 45

3-6-5 بافرهای وسترن بلاتینگ… 46

3-6-6 بافرهای مورد استفاده در تخلیص پروتئین با ستون نیکل.. 47

3-6-7 بافرهای مورد استفاده در تخلیص پریپلاسمیک: 47

3-6-8 بافرهای مورد استفاده در الایزا 48

3-6-9 بافرهای مورد استفاده برای تهیه سنجش سریع. 48

3-7 کیتهای استفاده شده 48

3-8 قطعه DNA کد کننده پروتئین.. 49

3-9 وکتورها 49

3-10 سویههای باکتریایی.. 51

3-11 آنتیبادیها 51

3-12 آنزیمها 52

3-13 بررسیهای کامپیوتری.. 52

3-13-1……………………………………………………………………………………………………………………………. بانکهای اطلاعاتی.. 52

3-13-2……………………………………………………………………………………………………………. جستجو برای توالیهای مشابه. 52

3-14 روشهای آزمایشگاهی.. 53

3-14-1…………………………………………………………………………………………………………………………………………. سنتز ژن. 53

3-14-2………………………………………………………………………………….. تهیه باكتري مستعد شده براي واكنش شیمیایی.. 54

3-14-3……………………………………………………………………………………………………… ترانسفورماسیون باکتری Top10. 54

3-14-4…………………………………………………………………………………………………………………………….. تخلیص پلاسمید. 55

3-14-5……………………………………………………………………………………………………………………………………… الکتروفورز. 56

3-14-6…………………………………………………………………………………………. ترانسفورماسیون باکتری BL21 (DE3) 58

3-14-7…………………………………………………………………………………………………………………………… القای بیان پروتئین.. 58

3-14-8…………………………………………………………………………. آمادهسازی نمونه برای آنالیز بیان با SDS-PAGE.. 59

3-14-9……………………………………………………………………………………………………………………… آنالیز SDS-PAGE.. 59

3-14-10 رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلو. 60

3-14-11 بیان با وسترن بلاتینگ… 61

3-14-12 بهینهسازی غلظت IPTG… 61

3-14-13 بهینهسازی مدت زمان القاء. 62

3-14-14 آمادهسازی ستون نیکل برای شرایط طبیعی.. 62

3-14-15 تخلیص پروتئین در شرایط طبیعی.. 63

3-14-16شارژ مجدد ستون. 64

3-14-17 تخلیص پریپلاسمیک… 65

3-14-18 تغلیظ پروتئینها 65

3-14-19 آمادهسازی کیسه دیالیز. 65

3-14-20 الایزای غیرمستقیم. 66

3-14-21 تهیه نانوذرات طلا.. 66

3-14- 22 تعیین pH و غلظت مناسب برای کونژوگاسیون آنتیژن با نانوذرات طلا.. 67

3-14-23 اتصال آنتیژن به نانوذرات طلا.. 67

3-14-23فیکس نمودن آنتیژن روی غشای نیتروسلولز. 67

3-14-24سنجش فعالیت پروتئین روی استرپهای نیتروسلولز. 68

3-14-25تعیین اختصاصیت و حساسیت : 68

4 نتایج.. 69

4-1 انتخاب آنتیژن. 69

4-2 مطالعات کامپیوتری.. 69

4-2-1 جستجو در بانکهای اطلاعاتی.. 69

4-2-2 بهینه سازی ژن. 69

4-3 سابکلونینگ و تایید آن. 71

4-4 ترانسفورماسیون باکتریهای Top10 و BL21 (DE3) 72

4-5 تائید ترانسفورماسیون و تخلیص پلاسمید. 72

4-6 بیان پروتئین.. 73

4-7 بهینهسازی غلظت IPTG… 74

4-8 انتخاب مدت زمان انکوباسیون. 75

4-9 تخلیص پروتئین به روش شوک اسمزی.. 76

4-10 تخلیص پروتئین با ستون نیکل.. 76

4-11 تائید بیان پروتئین با وسترن بلاتینگ… 77

4-12 کیسه دیالیز. 78

4-13 الایزای غیر مستقیم. 79

4-14 الایزای رقابتی.. 82

4-15 آمادهسازی نانوذرات طلا.. 82

4-16 اتصال آنتیژن به نانوذرات طلا.. 83

4-17 کت نمودن آنتیژن بر روی کاغذهای نیتروسلولز. 83

5 بحث و نتیجهگیری.. 85

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول شماره (1) نتایج جذب نوری پروتئین HBc با استفاده از سرم افراد آلوده به هپاتیتB 80

فهرست اشکال

عنوان صفحه

شکل( 4-1): نمودارهای مربوط به بهینه سازی ژن…………………………………………………………………………………………………… 71

شکل (4-2): ترانس فورماسیون باکتری های TOP10 و BL21. 72

شکل (4-3): پلاسمید تخلیص شده – تک باند تخلیص شده در ناحیه Kb6………………………………………………………… 72

شکل( 4-4 ): بررسی بیان پروتئین با SDS-PAGE . ستون1(سمت چپ) مارکر وزن مولکولی(لدر)، ستون وسط 2. 74

شکل( 4-5 ): بهینهسازی غلظت IPTG. سمت چپ اولین ستون لدر، کنترل و از ستون 8-3 القا با غلظتهای به ترتیب ،mM 2/0، 4/0، 6/0، 8/0، 1، 2/1 میباشد. 75

امتیاز 0 از 5 از 0 دیدگاه

قیمت اصلی: 45,000 تومان بود.قیمت فعلی: 21,000 تومان.

تاریخ ایجاد مهر 29, 1399
تاریخ بروزرسانی اسفند 13, 1401
فروش 0
دیدگاه 0

شرایط استفاده از محصول

تمام محصولات به ازای پرداخت پروژه تنها قابل استفاده می باشند. این بدین معنی است که برای استفاده از یک یا چند محصول ، لازم به خرید آن محصول است.

مزایای خرید این محصول:

دسترسی به فایل به صورت همیشگی
پشتیبانی رایگان
پشتیبانی 24 ساعته محصول
بازگشت وجه در صورت عدم رضایت مشتری

مشاهده قوانین سایت