تعیین گروه¬های فیلوژنتیکی و شناسائی جدایه¬های اشریشیاکلی تولید کننده بتالاکتاماز در مدفوع گربه¬های خانگی سالم

فهرست مطالب

عنوان………………………………………………………………………………………………………………………….صفحه

فصل اول           مقدمه و هدف

مقدمه:………………………………………………………………………………………………………………………………..2

فصل دوم                       کلیات

1-2- آنتروباکتریاسه…………………………………………………………………………………………………………….6

1-1-2- مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………….6

2-1-2- باکتری اشریشیا کلی…………………………………………………………………………………………………6

3-1-2-تاریخچه…………………………………………………………………………………………………………………7

4-1-2- طبقه­بندی……………………………………………………………………………………………………………….8

5-1-2- خصوصیات مورفولوژی……………………………………………………………………………………………8

6-1-2- خصوصیات کشت و بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………9

7-1-2- مقاومت……………………………………………………………………………………………………………….11

8-1-2- ژنتیک…………………………………………………………………………………………………………………12

2-2- ساختار آنتی­ژنی اشریشیا کلی………………………………………………………………………………………12

1-2-2- آنتی­ژن سوماتیک یا آنتی­ژن O ……………………………………………………………………………….13

2-2-2- آنتی­ژن کپسولی یا آنتی­ژن K………………………………………………………………………………….14

3-2-2- آنتی­ژن تاژکی یا آنتی­ژن H…………………………………………………………………………………….15

4-2-2- آنتی­ژن فیمبریه­ای یا آنتی­ژنF………………………………………………………………………………….15

3-2- بیماری­زایی باکتری اشریشیا کلی………………………………………………………………………………….16

1-3-2- فاکتور­های حدت…………………………………………………………………………………………………..16

1-1-3-2- کپسول…………………………………………………………………………………………………………….17

2-1-3-2- آندوتوکسین…………………………………………………………………………………………………….17

3-1-3-2- پروتئین های اتصالی فیمبریه ای…………………………………………………………………………….18

4-1-3-2- اگزوتوکسین ها…………………………………………………………………………………………………19

1-4-1-3-2- انتروتوکسین ها……………………………………………………………………………………………..19

2-4-1-3-2- سیتوتوکسین­ها………………………………………………………………………………………………20

3-4-1-3-2- وروتوکسین ها………………………………………………………………………………………………20

5-1-3-2- آلفا همولیزین ها………………………………………………………………………………………………..21

6-1-3-2- سیدروفور­ها………………………………………………………………………………………………………22

7-1-3-2- تغییر فاز آنتی­ژنی……………………………………………………………………………………………….22

8-1-3-2- سیستم ترشحی نوع …………………………………………………………………. III22

4-2- اهمیت اشریشیا کلی در سگ­ها و گربه­ها……………………………………………………………………….23

1-4-2- سویه­های بیماری­زای روده­ای (EPEC)……………………………………………………………………23

2-4-2- سویه­های انتروتوکسی ژنیک (ETEC)…………………………………………………………………….23

3-4-2- سویه­های مهاجم روده­ای (EIEC)…………………………………………………………………………..25

4-4-2- سویه­های خونریزی­دهنده روده­ای(EHEC)………………………………………………………………25

5-4-2- سویه­های نکروتوکسیژنیک (NETC)………………………………………………………………………26

6-4-2- سویه­های اوروپاتوژنیک (UPEC)……………………………………………………….26

7-4-2- سویه­های انترواگریگیتیو (EAEC or Eaggec)………………………………………………………27

5-2- عوامل حدت مرتبط با سویه­های اوروپاتوژنیک (UPEC)………………………………………………..27

1-5-2- همولیزین……………………………………………………………………………………………………………..27

2-5-2- آئروباکتین…………………………………………………………………………………………………………..27

3-5-2- فیمبریه P ……………………………………………………………………………………………………………28

4-5-2- سایر فیمبریه­ها……………………………………………………………………………………………………….28

5-5-2- زهرابه سیتوتوکسیک نکروز دهنده (cnf)…………………………………………………………………..29

6-5-2- آدزین­های خانواده afa………………………………………………………………………………………….29

6-2- بررسی فیلوژنی باکتری اشریشیا کلی……………………………………………………………………………..30

7-2-مقاومت در اشریشیا کلی………………………………………………………………………………………………31

1-7-2- آنتی بیوتیک­های بتالاکتام……………………………………………………………………………………….32

1-1-7-2- ساختمان و انواع آنتی­بیوتیک­های بتالاکتام……………………………………………………………..32

1-1-1-7-2- پنی­سیلین­ها……………………………………………………………………………………………………32

2-1-1-7-2- سفالوسپورین­ها………………………………………………………………………………………………33

3-1-1-7-2- دیگر آنتی­بیوتیک­های بتالاکتام………………………………………………………………………..33

2-1-7-2- مکانیسم اثر آنتی­بیوتیک­های بتالاکتام……………………………………………………………………34

3-1-7-2- مقاومت نسبت به آنتی­بیوتیک­های بتالاکتام…………………………………………………………….35

1-3-1-7-2- غیرفعال شدن دارو………………………………………………………………………………………….36

2-3-1-7-2- تخریب جایگاه تاثیری…………………………………………………………………………………….36

3-3-1-7-2- انسداد ورود به داخل یاخته………………………………………………………………………………37

2-7-2- آنزیم­های بتالاکتامازی……………………………………………………………………………………………38

1-2-7-2- انواع بتالاکتامازهای وسیع­الطیف…………………………………………………………………………..40

1-1-2-7-2- بتالاکتامازهای مقاوم به ممانعت­کننده­ها………………………………………………………………41

2-1-2-7-2- بتالاکتامازهای خانواده TEM …………………………………………………………………………..42

3-1-2-7-2- بتالاکتامازهای خانواده SHV…………………………………………………………………………….43

4-1-2-7-2- بتالاکتامازهای خانواده CTX-M……………………………………………………………………….44

5-1-2-7-2- بتالاکتامازهای خانواده OXA …………………………………………………………………………..45

6-1-2-7-2- ESBLs های دیگر…………………………………………………………………………………………45

2-2-7-2- بتالاکتامازهای AmpC مرتبط با پلاسمیدها……………………………………………………………..46

3-2-7-2-بتالاکتامازهای هیدرولیز کننده­ی کارباپنم­ها…………………………………………………………….47

3-7-2- مهارکننده­های آنزیم­های بتالاکتامازی……………………………………………………………………….48

8-2- تعیین حساسیت آنتی­بیوتیکی……………………………………………………………………………………….49

1-8-2- آزمایش انتشار دیسک یا انتشار آگار…………………………………………………………………………50

فصل سوم         مواد و روش کار

1-3- مواد و وسایل مورد استفاده………………………………………………………………………………………….52

1-1-3- مواد مصرفی………………………………………………………………………………………………………….52

2-1-3- مواد غیر مصرفی……………………………………………………………………………………………………53

2-3- روش کار…………………………………………………………………………………………………………………53

1-2-3- جمع­آوری و تقسیم­بندی نمونه­ها………………………………………………………………………………53

2-2-3- جداسازی و تایید بیوشیمیایی اشریشیا کلی………………………………………………………………….54

3-2-3- ذخیره نمونه­ها……………………………………………………………………………………………………….54

4-2-3- استخراج DNA از باکتری­ها…………………………………………………………………………………….55

5-2-3- آزمایش PCR جهت شناسایی ژن­های bla_TEM ، bla_SHV ، bla_CTX  و bla_{OXA…………………….}56

6-2-3- آزمایش PCR فیلوژنی…………………………………………………………………………………………..57

7-2-3- الکتروفورز و آنالیز محصولات PCR ………………………………………………………………………59

8-2-3- مراحل انجام الکتروفورز………………………………………………………………………………………….59

3-3- تعیین حساسیت آنتی­بیوتیکی……………………………………………………………………………………….61

1-3-3- تهیه سوسپانسیون میکروبی……………………………………………………………………………………….62

2-3-3- مرحله دیسک گذاری…………………………………………………………………………………………….62

فصل چهارم         نتایج

1-4- فیلوتایپینگ باکتری اشرشیاکلی جدا شده از مدفوع گربه­های خانگی سالم  براساس نتایج آزمایش PCR……………………………………………………………………………………………………………………………….64

2-4- نتيجه آزمايش PCR جهت شناسايي تحت گروه هاي فيلوژني……………………………………………65

3-4- شناسایی جدایه­های واجد ژن­های CTX-M-15، OXA، SHV-1 و TEM-1…………………………..66

4-4- تعیین گروه­ها و تحت گروه­های فیلوژنی جدایه­های واجد ژن­های bla_SHV ، bla_OXA و bla_CTX…………………………………………………………………………………………………………………………….68

5-4- نتايج تعيين حساسيت آنتي بيوتيك………………………………………………………………………………..69

1-5-4- تعیین جدايه­هاي حساس، متوسط و مقاوم به آنتی بیوتیک سفتازیدیم و سفوتاکسیم جدا شده از مدفوع گربه­های خانگی سالم……………………………………………………………………………………………….69

2-5-4- تعیین جدایه­های واجد آنزیم بتالاکتاماز وسیع الطیف جدا شده از مدفوع گربه­های خانگی سالم………………………………………………………………………………………………………………………………..70

فصل پنجم      بحث و نتیجه گیری

بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………….71

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………..77

فهرست جداول

جدول 1-3-  پرسش نامه جمع آوری اطلاعات از گربه های خانگی سالم…………………………………….54

جدول 2-3 – پرايمرها و سويه‌هاي استاندارد به کار رفته در PCR ژن هاي bla_TEM و bla_SHV و bla_CTX و bla_OXA…………………………………………………………………………………………………………………………….57

جدول 3-3- پرايمرها و سويه‌هاي استاندارد به کار رفته در PCR فيلوژني……………………………………..58

جدول 4-3- گروه های مختلف فیلوژنی………………………………………………………………………………..59

جدول 5-3- آنتي بيوتيک هاي استفاده شده به همراه کد اختصاصي و منطقه ممانعت از رشد آن ها طبق دستورالعمل شرکت سازنده………………………………………………………………………………………………….62

جدول 1-4 – تعداد و درصد گروه­های فیلو ژنی اشریشیاکلی جدا شده از مدفوع گربه­های خانگی سالم

………………………………………………………………………………………………………………………………………64

جدول 2-4- تعداد و درصد تحت گروه­های فیلو ژنی اشریشیاکلی جدا شده از مدفوع گربه­های خانگی سالم………………………………………………………………………………………………………………………………..65

جدول3-4- تعداد و درصد ژن­های مربوط به مقاومت آنتی­بیوتیکی بتالاکتام وسیع الطیف در

 اشریشیا­کلی جدا شده از مدفوع گربه­های خانگی سالم……………………………………………………………..66

جدول4-4- گروه­ها و تحت گروه­های فیلوژنی جدایه های واجد ژن­های bla_SHV ، bla_OXA و bla_CTX…………………………………………………………………………………………………………………………….68

جدول5-4- جدايه­هاي حساس، متوسط و مقاوم به آنتی بیوتیک سفتازیدیم و سفوتاکسیم……………….69

فهرست نمودارها

نمودار 1-4- درصد گروه­های فیلو ژنی اشریشیاکلی جدا شده از مدفوع گربه­های خانگی سالم………..65

نمودار 2-4- درصد تحت گروه­های فیلو ژنی اشریشیاکلی جدا شده از مدفوع گربه­های خانگی سالم..66

نمودار3-4- فراوانی ژن­های مربوط به مقاومت آنتی­بیوتیکی بتالاکتام وسیع الطیف در اشریشیا­کلی جدا شده از مدفوع گربه­های خانگی سالم……………………………………………………………………………………..67

فهرست تصاویر

تصویر1-4-  آزمايش PCR جهت شناسایی ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی………………………………..67

تصویر2-4- نتايج آزمايش PCR جهت تعيين گروه ها و تحت گروه هاي فيلوژني……………………….68