جداسازی سویه های مولد آنزیم پروتئاز از چشمه های آبگرم و شناسایی سویه ی برتر

1-1 آنزیمهای میکروبی. 3

1-2 تاریخچهی آنزیمهای پروتئولیتیک. 3

1-3 پروتئاز. 4

1-4 منابع میکروبی تولید کنندهی آنزیم پروتئاز. 5

1-4-1 باکتریهای تولید کنندهی آنزیم پروتئاز. 6

1-4-2 آرکیهای تولید کنندهی آنزیم پروتئاز. 6

1-5 انواع پروتئازها. 7

1-5-1 طبقه بندی پروتئازها بر اساس نوع واکنشی که کاتالیز میکنند:   7

1-5-1-1 اگزوپپتیدازها…………………………………………………………………………………………………………….7

1-5-1-2 اندوپپتیدازها…………………………………………………………………………………………………………….8

1-5-2 طبقه بندی پروتئازها بر اساس ماهیت شیمیایی سایتهای کاتالیزوری. 8

1-5-3 طبقه بندی پروتئازها بر اساس pH محل فعالیتشان. 9

1-5-4 طبقه بندی پروتئازها بر اساس ارتباط تکاملی ساختار پروتئازها   9

1-6 مکانیسم عملکرد پروتئاز. 10

1-7 عملکرد سلولی و فیزیولوژیکی پروتئازها. 12

1-8 روشهای سنجش فعالیت آنزیم پروتئاز. 13

1-8-1 سنجش همگن:. 14

1-8-2 سنجش مبتنی بر جدایی. 15

1-9 کاربردهای آنزیم پروتئاز. 15

1-9-1 کاربرد پروتئازها در شویندهها. 16

1-9-2 کاربرد پروتئازها در چرم سازی. 16

1-9-3 کاربرد پروتئاز در صنایع غذایی. 17

1-9-3-1 صنایع لبنی…………………………………………………………………………………………………………..18

1-9-3-2 صنعت پخت نان……………………………………………………………………………………………………18

1-9-3-3 تهیه محصولات سویا……………………………………………………………………………………………..19

1-9-4 کاربرد پروتئازها در پزشکی. 19

1-9-4-1 کاربرد پروتئازهای نوترکیب در درمان سکته­ی قلبی……………………………………………………19

1-9-4-2 کاربرد پروتئاز در حذف بیوفیلم روی پروتزها…………………………………………………………….20

1-9-4-3 کاربرد پروتئاز در دبریدمان زخم­ها…………………………………………………………………………..20

1-9-4-4 تلاش برای استفاده از پروتئازها در درمان آنتی­بیوتیکی……………………………………………….20

1-9-5 سایر کاربردهای پروتئاز. 20

1-10 مزیت آنزیمهای مقاوم به حرارت به سایر آنزیمها. 21

1-11 اکسترموفیلها. 22

1-11-1 ترموفیلها. 22

1-11-2 تاریخچهی ترموفیلها. 23

1-11-3 ارتباط فیلوژنتیکی ترموفیلها. 24

1-11-4 منبع انرژی و روش زندگی هایپرترموفیلها. 25

1-11-5 زیستگاههای ترموفیلها و هایپرترموفیلها. 27

1-11-6 تنوع ترموفیلها و هایپرترموفیلها. 28

1-11-7 چگونه پروتئینها به گرما مقاومت میکنند؟. 29

1-11-8 مکانیسمهای غیرفعالسازی پروتئینهای ترموفیلها. 32

1-11-9 مکانیسمهای پایداری حرارتی پروتئینها. 37

1-12 پروتئازهای ترموفیل. 38

2مواد و روش­ها ……. 41

2-1 مواد و تجهیزات. 41

2-1-1 مواد و محیط­های کشت. 41

2-1-2 دستگاه­های مورد استفاده. 42

2-1-3 میکروارگانیسم­ها. 42

2-2 روش­ها. 43

2-2-1 غربال کردن و جدا سازی سویه­های تولید کنندهی آنزیم پروتئاز   43

2-2-1-1نمونه برداری آب و خاک از چشمه قینرچه…………………………………………………………………….43

2-2-2 غربال کردن و جداسازی سویه­ها. 45

2-2-3 خالص سازی نمونه­ها. 46

2-2-4 نام گذاری سویه­های جدا شده. 47

2-2-5 سنجش بهینه دمای رشد سویه­های جدا شده. 47

2-2-6 سنجش منحنی رشد نمونه­های جدا شده. 47

2-2-7 سنجش بهینه­ی pH رشدی نمونه­های جدا شده. 48

2-2-8 سنجش توان تولید آنزیم پروتئاز در سویه­های جدا شده. 48

2-2-8-1 محیط حاوی اسکیم میلک……………………………………………………………………………………..48

2-2-8-2 کشت سویه­های پروتئاز مثبت در محیط سنتتیک ………………………………………………………49

2-2-9 بهینه سازی محیط کشت و عوامل محیطی. 50

2-2-9-1 هوادهی ………………………………………………………………………………………………………………51

2-2-9-2 pH محیط……………………………………………………………………………………………………………52

2-2-9-3 دمای کشت………………………………………………………………………………………………………….52

2-2-9-4 میزان تلقیح …………………………………………………………………………………………………………52

2-2-10 سنجش آنزیم پروتئاز. .52

2-2-10-1 آماده سازی محلول­ها ………………………………………………………………………………………….53

2-2-10-2 تهیه معرف فولین فنول ……………………………………………………………………………………….54

2-2-10-3 روش سنجش پروتئاز و منحنی استاندارد……………………………………………………………….54

2-2-10-4 منحنی استاندارد تیروزین…………………………………………………………………………………….55

2-2-10-5 روش رنگ سنجی ………………………………………………………………………………………………..56

2-2-10-5-1 اندازه­گیری جذب نوری …………………………………………………………………………………….57

2-2-10-5-2 محاسبه فعالیت آنزیم………………………………………………………………………………………57

2-2-10-5-3 بررسی ویژگی­های آنزیم پروتئاز………………………………………………………………………..57

2-2-10-5-3-1 بهینه دمای فعالیت آنزیم ………………………………………………………………………………..57

2-2-10-5-3-2 تعیین پایداری دمایی آنزیم……………………………………………………………………………….58

2-2-10-5-3-3 تعیین پایداری pH آنزیم …………………………………………………………………………………58

2-2-10-5-4 انتخاب سویه با توان تولید زیاد………………………………………………………………………….59

2-3 شناسایی سویه­های جدا شده از چشمه. 59

2-3-1 بررسی کلنی میکروارگانیسم توسط لوپ. 59

2-3-2 بررسی میکروسکوپی با رنگ آمیزی. 59

2-3-3 شناسایی مولکولی سویه. 60

2-3-3-1 استخراج DNA از میکروارگانیسم­های مورد بررسی …………………………………………………….60

2-3-3-1-1 محلول­های لازم برای استخراج DNA…………………………………………………………………….60

2-3-3-1-2 مراحل استخراج DNA.. 62

2-3-3-2 واکنش PCR.. 62

2-3-3-3 ژل الکتروفورز. 63

2-3-3-4 توالی­یابی سویه­ها ……………………………………………………………………………………………………65

3 فصل سوم نتایج…….. 67

3-1 غربال­کردن محیط و جداسازی سویه­ها از یکدیگر. 67

3-1-1 نتایج غربالگری محیطی و نامگذاری نمونه­ها. 67

3-1-2 نتایج حاصل از خالص­سازی نمونه­ها. 67

3-2 نتایج حاصل از سنجش بهینه دمای رشد سویه­های جدا شده. 68

3-2-1 بهینه دمای رشد سویهp-4. 68

3-2-2 بهینه دمای رشد سویه p-22. 69

3-2-3 بهینه دمای رشد سویه p^/-2. 70

3-2-4 بهینه دمای رشد سویه  p^//-2. 71

3-2-5 بهینه دمای رشد سویه F-5. 72

3-3 بهینه­ی pH رشد سویه­های جدا شده. 73

3-3-1 بهینه­ی  pHرشد سویه p-4. 73

3-3-2 بهینه­ی  pHرشد سویه p-22. 74

3-3-3 بهینه­ی pH رشد سویه p^/-2. 75

3-3-4 بهینه­ی pH رشد سویه  p^//-2. 76

3-3-5 بهینه­ی  pHرشد سویه  F-5. 76

3-4 نتایج حاصل از توان تولید آنزیم پروتئاز در نمونه­های جدا شده   77

3-4-1 محیط حاوی اسکیم میلک. 77

3-5 بررسی عوامل موثر بر تولید آنزیم سویه­های پروتئاز مثبت در محیط سنتتیک. 79

3-5-1 تأثیر هوادهی بر تولید آنزیم. 79

3-5-2 نتایج حاصل از تأثیر pH محیط بر تولید آنزیم. 88

3-6 تأثیر دما بر تولید آنزیم. 93

3-7 تأثیرمیزان تلقیح بر تولید آنزیم. 94

3-8 نتایج ویژگیهای آنزیم پروتئاز. 95

3-8-1 منحنی استاندارد. 95

3-9 شناسایی سویه­های جدا شده از چشمه. 106

3-9-1 مشخصات ماکروسکوپی سویه­ها. 107

3-9-2 بررسی میکروسکوپ نوری با رنگ آمیزی. 110

3-9-3 شناسایی سویه­ی p-4 به وسیله­ی میکروسکوپ الکترونی نگاره   112

3-10 شناسایی مولکولی سویه­ها. 113

3-11 نتایج توالی یابی. 114

3-11-1 نتایج توالی یابی سویه P-4. 115

3-11-2 نتایج توالی یابی سویه F-5. 115

3-11-3 نتایج توالی یابی سویه P^/-2. 116

3-11-4 نتایج توالی یابی سویه P-22. 117

3-11-5 نتایج توالی یابی سویه P^//-2. 117

4 بحث……. 119

4-1 اهداف تحقیق:. 124

4-2 پیشنهادات تحقیق:. 124