بررسي اثر عصاره سنبل‌الطيب بر مخلوط سلول‌هاي مغزي موش صحرايي

صفحه                                                                                        عنوان

1- مقدمه………………………………………………………………………………………………… 3

1-1- آشنايي با بيماريهاي نورودژانيرو……………………………………………………………. 3

1-2- سيستم عصبي مركزي ( CNS)……………………………………………………………… 4

1-3- نوروگليا…………………………………………………………………………………………. 6

1-4- طبقه‌بندي سلولهاي گليال براساس منشأ…………………………………………………… 7

1-4-1- آستروسيت‌ها……………………………………………………………………………….. 8

1-4-2- ميكروگلياها…………………………………………………………………………………. 8

1-4-3- اليگودندروسيت‌ها…………………………………………………………………………. 9

1-4-4- اپانديم‌ها……………………………………………………………………………………… 9

1-5- عملكرد ميكروگليا…………………………………………………………………………….. 10

1-6- روند التهاب…………………………………………………………………………………….. 10

1-7- بيان ژن در سلولهاي گليا…………………………………………………………………….. 11

1-8- مقدمه گياهي……………………………………………………………………………………. 12

1-9- عناصر تشيكل دهنده گياه (متابوليت)……………………………………………………… 14

1-9-1- متابوليت‌ها…………………………………………………………………………………… 14

1-9-2- متابوليت‌هاي ثانويه………………………………………………………………………… 15

1-9-2-1- آلكالوئيدها………………………………………………………………………………. 16

1-9-2-2- ترپنوئيدها………………………………………………………………………………… 17

1-9-2-3- گليكوزيدها……………………………………………………………………………… 18

1-9-2-4- افزايش متابوليت‌هاي ثانويه…………………………………………………………… 18

1-10-1- استفاده از علم بيوتكنولوژي……………………………………………………………. 19

1-10-2- كشت سلولهاي گياهي براي توليد متابوليت‌هاي ثانويه……………………………. 19

1-10-3- انتخاب لاين‌ها سلولي با قابليت توليد بالا…………………………………………… 20

1-10-4- بهينه‌سازي عناصر غذايي و تنظيم كننده‌هاي رشد محيط…………………………. 20

الف) قند………………………………………………………………………………………………… 20

ب) نيتروژن…………………………………………………………………………………………….. 20

ج) فسفات……………………………………………………………………………………………… 20

د) تنظيم كننده‌هاي رشد………………………………………………………………………………. 20

ه) پيش ماده‌ها………………………………………………………………………………………….. 21

1-11- گياه دارويي سنبل‌الطيب…………………………………………………………………….. 21

1-12- تركيبات سنبل‌الطيب…………………………………………………………………………. 23

1-13- استخراج عصاره……………………………………………………………………………… 25

1-14- فرضيات……………………………………………………………………………………….. 25

1-15- اهداف………………………………………………………………………………………….. 26

2- سوابق تحقيقات…………………………………………………………………………………… 28

2-1- تأثيرات دارويي سنبل‌الطيب …………………………………………………………………. 28

2-2- اثرات سنبل‌الطيب بر سيستم عصبي………………………………………………………… 29

2-3- تأثيرات دارو بر كاهش التهاب گليال……………………………………………………….. 30

2-4- تأثير گياهان دارويي بر بقاي سلولهاي مغزي……………………………………………… 31

2-5- دژنراسيون مغزي و گياهان دارويي………………………………………………………… 32

2-6- معرفي سلولهاي گليال………………………………………………………………………… 33

3- مواد و روشها………………………………………………………………………………………. 35

3-1- تجهيزات مورد نياز……………………………………………………………………………. 35

3-2- محيط كشت جانوري DMEM…………………………………………………………….. 39

3-3- تريپسين…………………………………………………………………………………………. 40

3-4- بافر فسفات PBS……………………………………………………………………………… 41

3-5- نيتريت سديم…………………………………………………………………………………… 41

3-6- ليپوپلي ساكارايد  LPS……………………………………………………………………….. 42

3-7- گريس……………………………………………………………………………………………. 43

3-8- MTT…………………………………………………………………………………………….. 43

3-9- آماده‌سازي براي كشت سلول جانوري…………………………………………………….. 44

3-9-1- كشت سلول‌هاي مخلوط مغز موش……………………………………………………. 44

3-10- جداسازي سلولها (تريپسينه كردن)……………………………………………………….. 46

3-11- شمارش سلولي………………………………………………………………………………. 46

3-12- تيمار سلولها………………………………………………………………………………….. 47

3-13- تست گريس و اندازه‌گيري NO………………………………………………………….. 48

3-14- تست MTT…………………………………………………………………………………… 49

3-15- استخراج RNA از سلولها………………………………………………………………….. 50

3-16- ساخت CDNA……………………………………………………………………………… 51

3-17- PCR…………………………………………………………………………………………… 52

3-18- الكتروفورز محصول PCR…………………………………………………………………. 53

3-19- پرايمرها……………………………………………………………………………………….. 54

3-20- RT-PCR……………………………………………………………………………………… 54

3-21- محيط كشت گياهي………………………………………………………………………….. 56

3-22- محيط كشت MS…………………………………………………………………………….. 58

3-23- محيط كشت داراي هورمون……………………………………………………………….. 58

3-24- غلظتهاي هورموني…………………………………………………………………………… 59

3-25- شكستن خواب بذرها……………………………………………………………………….. 60

3-26- استريل كردن بذر و كشت آن در محيط MS…………………………………………… 60

3-27- القا و رشد كالوس…………………………………………………………………………… 61

3-28- عصاره‌گيري از گياه………………………………………………………………………….. 61

3-29- آناليز آكاري…………………………………………………………………………………… 61

4- نتايج…………………………………………………………………………………………………. 63

4-1- كشت سلولهاي مغزي نوزاد موش صحرايي……………………………………………… 63

4-2- جداسازي سلولهاي كشف شده مغزي…………………………………………………….. 66

4-3- شمارش سلولهاي جدا شده………………………………………………………………….. 67

4-4- تيمار سلولها توسط عصاره خشك سنبل‌الطيب………………………………………….. 68

4-5- تيمار سلولها توسط عصاره الكلي سنبل‌الطيب……………………………………………. 69

4-6- تيمار سلولها توسط LPS و تركيب LPS و دارو………………………………………… 70

4-7- اندازه‌گيري قابليت LPS در غلظتهاي مختلف……………………………………………. 71

4-8- اندازه‌گيري ميزان توليد NO در تيمار با 2 عصاره و الكلي از گياه سنبل‌الطيب……..

4-9- اندازه گيري ميزان بقاء سلولي در مجاورت عصاره خشك و الكلي سنبل‌‌الطيب……

4-10- اندازه‌گيري ميزان تأثيرگذاري LPS در غلظتهاي مختلف…………………………….. 86

4-11- بررسي بيان ژنها توسط RT-PCR………………………………………………………… 87

4-12- شكستن خواب بذر و كشت درون شيشه گياه سنبل‌الطيب………………………….. 90

4-13- انتقال بذرهاي جوانه‌زده به ليوانهاي شيشه‌اي…………………………………………… 93

4-14- واكشت گياه سنبل‌الطيب……………………………………………………………………. 94

4-15- جمع‌آوري گياه و خشك كردن……………………………………………………………. 94

4-16- تهيه عصاره آبي از گياه خشك……………………………………………………………. 95

4-17- تهيه عصاره الكلي از گياه خشك…………………………………………………………. 96

4-18- تهيه عصاره خشك يكنواخت از عصاره آبي……………………………………………. 96

5- بحث و نتيجه‌گيري……………………………………………………………………………….. 98

منابع……………………………………………………………………………………………………… 108

چكيده انگليسي……………………………………………………………………………………….. 115

 

 

فهرست تصاوير

صفحه                                                                                        عنوان

1-1- سلولهاي بافت عصبي………………………………………………………………………… 6

1-2- انواع سلولهاي گليا…………………………………………………………………………….. 7

1-3- سلولهاي نوروگليا……………………………………………………………………………… 9

1-4- گياه سنبل‌الطيب………………………………………………………………………………… 21

3-1- مراحل آماده‌سازي كشت جانوري………………………………………………………….. 46

3-2- لام همو ساتيو متر……………………………………………………………………………… 47

3-3- تست گريس بر روي سلولهاي تيمار شده………………………………………………… 48

3-4- واكنش شيميايي  ………………………………………………………………………… 49

3-5- توليد كريستالهاي فارمانزان………………………………………………………………….. 50

4-1- مراحل كشت سلولهاي مغزي نوزاد موش………………………………………………… 64

4-2- جدا شدن سلولها………………………………………………………………………………. 66

4-3- شمارش سلولي………………………………………………………………………………… 67

4-4- تيمار سلولها در پليت…………………………………………………………………………. 68

4-5- تيمار سلولها با عصاره الكلي………………………………………………………………… 69

4-6- تيمار سلولها با LPS………………………………………………………………………….. 70

4-7- پليتهاي تيمار شده با عصاره آبي و الكلي…………………………………………………. 72

4-8- نتايج iNOS در RT-PCR…………………………………………………………………… 89

4-9- نتايج TNF-∝ در RT-PCR………………………………………………………………… 90

4-10- مراحل رشد بذر گياه سنبل‌الطيب…………………………………………………………. 91

4-11- مراحل انتقال جوانه به ليوان……………………………………………………………….. 93

4-12- واكشت سنبل‌الطيب ………………………………………………………………………… 94

4-13- دستگاه رفلاكس……………………………………………………………………………… 95

4-14- دستگاه رتاري………………………………………………………………………………… 96

فهرست نمودارها

صفحه                                                                         عنوان

4-1- ميزان توليد NO در تيمار 1 ساعته………………………………………………….. 71

4-2- ميزان توليد NO در غلظتهاي مختلف……………………………………………… 73

4-3- ميزان توليد NO در تيمار 1 ساعته LPS و عصاره الكلي…………………… 74

4-4- ميزان توليد NO در تيمار 1 ساعته LPS و عصاره آبي………………………. 76

4-5- ميزان توليد NO در تيمار 24 ساعته LPS و عصاره الكلي……………… 77

4-6- ميزان توليد NO در تيمار 24 ساعته LPS و عصاره آبي……………………. 79

4-7- ميزان بقا در تيمار 1 ساعته عصاره الكلي………………………………………….. 81

4-8- ميزان بقا در تيمار 1 ساعته عصاره آبي…………………………………………….. 82

4-9- ميزان بقا در تيمار 24 ساعته عصاره الكلي……………………………………….. 84

4-10- ميزان بقا در تيمار 24 ساعته عصاره آبي………………………………………… 85

4-11- مقايسه كلي بقا در زمانهاي مختلف………………………………………………. 86

فهرست جداول

عنوان                                                                          صفحه

1-1- ميزان اسانسهاي سنبل‌الطيب……………………………………………………………. 23

1-2- اجزاء والرين…………………………………………………………………………………. 24

3-1- مواد مورد استفاده بخش جانوري……………………………………………………. 37

3-2- مواد مورد استفاده بخش گياهي………………………………………………………. 38

3-3- عناصر DMEM…………………………………………………………………………… 39

3-4- محلول تريپسين……………………………………………………………………………. 40

3-5- محلول PBS……………………………………………………………………………….. 41

3-6- محلول نيرتيت سديم…………………………………………………………………….. 41

3-7- محلول LPS ……………………………………………………………………………….. 42

3-9- محلول گريس………………………………………………………………………………. 43

3-10- محلول MTT…………………………………………………………………………….. 43

3-11- مواد مورد استفاده ساخت CDNA………………………………………………. 51

3-12- واكنشگرهاي PCR…………………………………………………………………….. 52

3-13- برنامه PCR……………………………………………………………………………….. 53

3-14- ژل  آگارز………………………………………………………………………………….. 53

3-15- مشخصات پرايمرها…………………………………………………………………….. 54

3-16- برنامه RT- PCR……………………………………………………………………….. 55

3-17- عناصر MS………………………………………………………………………………… 57

3-18- محلول استوك هورموني……………………………………………………………… 59

3-19- غلظتهاي هورموني………………………………………………………………………. 60

4-1- تجزیه واریانس NO ……………………………………………………………………………….75

4-2- تجزیه واریانس غلظتهای مختلف الکلی ………………………………………………………..

4-3- تجزیه واریانس میزان بقا MTT ………………………………………………………………..83

4-4- مقایسه میانگین غلظتهای LPS …………………………………………………………………..87

4-5- مقایسه میانگین جوانه زنی ……………………………………………………………………….78

4-6- مقایسه میانگین تعداد برگچه ………………………………………………………………….92