فهرست مطالب
فصل اول: مقدمه1-1- سلولدرمانی…………………………………………………………………………………………………………….11-2- سلولهای بنیادی……………………………………………………………………………………………………11-2-1- سلولهای بنیادی جنینی……………………………………………………………………………………41-2-2- سلولهای بنیادی بالغ…………………………………………………………………………………………51-2-3- سلولهای بنیادی خون بندناف…………………………………………………………………………..61-2-3-1- سلولهاي بنيادي سوماتیکی نامحدود(USSC)…………………………………………..71-3- تمايز سلولهاي بنيادي به سمت سلولهای استخوانی………………………………………….81-4- مسیر پیامرسانی Wnt……………………………………………………………………………………………91-4-1- مسیرهای پیام رسانی Wnt…………………………………………………………………………….101-4-2- اجزای مسیر اصلی Wnt………………………………………………………………………………….111-4-2-1- Frizzled(Fz)…………………………………………………………………………………………..131-4-2-2- LRP5/6…………………………………………………………………………………………………….131-4-2-3- Dvl……………………………………………………………………………………………………………..141-4-2-4- اکسین…………………………………………………………………………………………………………..141-4-2-5- GSK_3β………………………………………………………………………………………………….141-4-2-6- پروتئين مهار كننده تومورAPC…………………………………………………………………151-4-2-7- بتاکتنین……………………………………………………………………………………………………….151-4-2-8- sFRP………………………………………………………………………………………………………….161-4-2-9- Dkk……………………………………………………………………………………………………………171-5- ژنهای هدف مسیر Wnt……………………………………………………………………………………181-6- فعال کنندههای مسیر سیگنالینگ Wnt…………………………………………………………….181-6-1- BIO…………………………………………………………………………………………………………………191-7- سلولهاي بنيادي جنيني و مسير پيام رساني Wnt………………………………………191-8- تمایز آدیپوسیتی و استئوبلاستی و مسير پيامرساني Wnt……………………………….201-9- هدف از انجام پژوهش…………………………………………………………………………………………..22فصل دوم: مواد و روشها2-1- مواد و دستگاههای مورد استفاده………………………………………………………………………….242-2- سلولهای بنیادی سوماتیک نامحدود…………………………………………………………………..262-3- محلولهای مورد استفاده در کشت سلولهای بنیادی سوماتیکی نامحدود………..262-4- محیط کشت کامل جهت نگهداری سلولهای بنیادی سوماتیکی نامحدود………..262-5- تعويض محيط كشت سلولهای بنیادی سوماتیکی نامحدود………………………………262-6- پاساژ سلولهای بنیادی سوماتیکی نامحدود……………………………………………………….272-7- منجمد کردن سلولهای بنیادی سوماتیکی نامحدود………………………………………….272-8- ذوب کردن سلولهای بنیادی سوماتیکی نامحدود……………………………………………..282-9- شمارش سلولها به روش تریپان بلو……………………………………………………………………282-10- محیط کشت تمایزی سلولهای بنیادی سوماتیکی نامحدود به استخوان………..292-11- رنگآمیزی سلولهای استخوانی………………………………………………………………………..302-11-1- پروتکل آماده سازی رنگ آلیزارین رد………………………………………………………….302-11-2- پروتکل رنگآمیزی آلیزارین رد……………………………………………………………………302-12- سنجش ماتریکس استخوان……………………………………………………………………………….302-12-1- مراحل کار سنجش ماتریکس استخوان………………………………………………………….312-13- اندازهگيری فعاليت آلکالين فسفاتاز…………………………………………………………………..312-14- اندازهگيری ميزان رسوبات کلسيمدار………………………………………………………………..322-15- رنگآمیزی سلولهای چربی……………………………………………………………………………..322-15-1- پروتکل آماده سازی رنگ Oil red……………………………………………………………….322-15-2- پروتکل رنگآمیزی با Oil red……………………………………………………………………..322-16- ایمونوسیتوشیمی…………………………………………………………………………………………………..332-16-1- مواد لازم برای آزمایش ایمونوسیتوشیمی……………………………………………………….332-16-1-1- طرز تهيه پارافرمالدهيد 4%………………………………………………………………………..332-16-1-2- طرز تهيه x 100Triton 04/0% در بافر PBS…………………………………….342-16-1-3- طرز تهيه BSA/PBS 3%……………………………………………………………………….342-16-1-4- طرز تهيهTween 20……………………………………………………………………………….342-16-2- مراحل ايمونوسيتوشيمي…………………………………………………………………………………342-17- بررسی بیان ژنهای تمایزی با استفاده از تکنیکreverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)………………………………………………………….352-17-1- مراحل انجام RT-PCR…………………………………………………………………………………352-17-1-1- استخراجRNA …………………………………………………………………………………………352-17-1-2- سنتز cDNA (complementary DNA)………………………………………..372-17-1-3- واکنش زنجیره پلی مرازی (PCR)………………………………………………………….372-17-2- بار گیری نمونهها روی ژل الکتروفورز……………………………………………………………..392-18- بررسی کمی بیان ژنهای تمایزی با تکنیک Real time PCR……………………..402-18-1- Real- time PCR در مقابل PCR معمولی……………………………………………..402-18-2- تعریف Real-time PCR…………………………………………………………………………….402-18-3- اساس تکنیک Real-time PCR………………………………………………………………..412-18-4- آماده سازی نمونهها…………………………………………………………………………………………422-19- آنالیز های آماری………………………………………………………………………………………………..42فصل سوم: نتایج3-1- مورفولوژی و فنوتیپ سلولهای بنیادی USSC…………………………………………………433-2- تمایز سلولهای بنیادی USSC به سلولهای استخوانی……………………………………433-3- اثرBIO به عنوان مهار کننده GSK_3βدر تمایزسلول های USSCبه سلولهای استخوانی………………………………………………………………………………………………………………….443-4- تمایز چربی سلولهای USSC در اثر مهار تمایز استخوانی با BIO………………….473-5- بررسی فعالیت بتاکتنین در حضور BIO……………………………………………………………..493-6- سنجش میزان رسوبات کلسیم………………………………………………………………………………513-7- فعالیت آلکالین فسفاتاز………………………………………………………………………………………….533-8- سنجش ماتریکس استخوانی………………………………………………………………………………….543-9- بررسی بیان ژن………………………………………………………………………………………………………55فصل چهارم: بحثبحث………………………………………………………………………………………………………………………………….584-1- BIO باعث افزایش بتاکنین هستهای میشود……………………………………………………..594-2- BIO باعث مهار تمایز استخوانی میشود……………………………………………………………..604-3- همزمان با مهار تمایز استخوانی، القای تمایز چربی در عدم حضور محیط القاکننده چربی صورت میگیرد……………………………………………………………………………………………………….62فصل پنجم: منابعمنابع………………………………………………………………………………………………………………………………….64 |